凡隆气单胞菌(Aeromonas veronii)拮抗菌4-1-3的筛选鉴定及其活性物质初探

凡隆气单胞菌是泥鳅养殖中容易发生而且致死率较高的病原菌之一。为筛选凡隆气单胞菌拮抗菌、研发防治此病害的生物制剂,采集泥鳅养殖池底泥样品,通过滤纸抑菌圈法筛选凡隆气单胞菌拮抗细菌,结合形态观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定。采用硫酸铵沉淀和离子交换层析方法分离纯化抑菌物质,电泳检测其分子量。结果显示,从样品中分离到17株细菌,其中筛选出的拮抗菌4-1-3,能够高效抑制凡隆气单胞菌,抑菌圈直径达到15.2 mm。经菌株鉴定后命名为Pseudomonas fluorescens 4-1-3。该菌产生的抑菌物质为胞外蛋白,分子量约为100 kDa,推测该物质是荧光假单胞菌产生拮抗物质的一种新类型,有望进一步研制成防治水产病害的生物制剂。     

泥鳅体内凡隆气单胞菌拮抗细菌CMA 1的分离筛选及其抑菌活性

本研究从泥鳅养殖水体、底泥、健康泥鳅和患病泥鳅肠道等环境中采集样品,从中分离纯化出对凡隆气单胞菌具有拮抗作用的细菌57株.在TSB平板上采用牛津杯法进行体外拮抗实验,筛选出一株对凡隆气单胞菌具有明显拮抗作用的菌株CMA-1,经形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列系统发育分析,将该菌鉴定并命名为Bacillus methylotrophicus CMA-1.菌株CMA-1生长24 h后进入稳定期,36 h时发酵上清液抑菌活性达到最大.对菌株CMA-1的发酵上清液采用硫酸铵分级沉淀,测得75％硫酸铵饱和度下的沉淀粗提物抑菌活性最高.     

耐盐红螺菌对水产养殖病害细菌的拮抗作用

为探明光合理细菌对水产养殖动物病害的生物防治功能，对病鳖、鳗及南美白对虾动物体上的病原菌进行分离、纯化与鉴定，人工感染健康动物检测致病性；探讨耐盐红螺菌对病害细菌分离株的仰菌效能，和有效抑菌作用时细胞所处的生长期。试验结果表明，水产动物病害细菌分离株为孤菌属，气单胞菌属和假单胞菌属菌株；耐盐红螺菌的代谢产物对商害细菌分离株均有抑制作用，其平坂柳菌圈为1.2-1.4cm，最低抑菌浓度多为4-8倍稀释液；耐盐红螺菌的拮抗物质随细胞对数生长过程中生成，至细胞衰亡期达到最大值。     

草鱼病原菌AvX005的分离鉴定及其拮抗菌筛选研究

2016年4—7月,湖南望城乔口渔场爆发了较大范围的草鱼疾病,自爆发病的草鱼病变组织中进行细菌分离与培养,分离得到一株优势菌,回复感染试验测定,该菌株具有较强的致病性。经菌落形态观察、冷场扫描电镜观察、生理生化试验及16SrDNA基因序列同源性分析,鉴定为维氏气单胞菌,编号为AvX005(GenBank登录号:KU64116.1),在此基础上以维氏气单胞菌AvX005为指示菌,通过点种法和纸片扩散法筛选拮抗菌,拮抗试验发现新筛选的解淀粉芽孢杆菌对维氏气单胞菌AvX005有较好的拮抗效果,采用酸沉淀、C18反相柱色谱分离到抑菌活性物,LC-MS/MS鉴定分子量为1045.29。根据抑菌活性物的理化性质,初步确定解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌活性物可能为脂肽类化合物。该研究不仅可为快捷、准确检测由维氏气单胞菌引起的鱼类疾病提供参考及填补国内维氏气单胞菌拮抗菌在分类地位、生物学特性等方面的不足,而且也为我国草鱼维氏气单胞菌病的生物防治提供科学资料。     

泥鳅白头病病原菌的分离鉴定、药敏试验及拮抗菌的筛选

为确定连云港市墩尚镇泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)白头病的病原菌,本研究采用常规微生物分离鉴定技术和分子生物学相关方法,对患病泥鳅进行病原菌的分离、鉴定并分析其药物敏感性,采用滤纸片抑菌圈法筛选了该病原菌的拮抗菌。从患病泥鳅病灶部位分离到1株病原菌并命名为W1,经人工感染发现体腔注射浓度为1.6×10~7 CFU/mL 0.1 mL菌液时泥鳅死亡率为80%,在1.6×10~7 CFU/mL浓度下创伤和浸泡感染死亡率为100%。通过形态特征观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析,将该病原菌初步鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。药敏试验结果显示,该菌株对头孢克肟高度敏感,对呋喃唑酮、链霉素、庆大霉素和恩诺沙星中度敏感,对红霉素、环丙沙星、四环素等不敏感。筛选该病原菌的拮抗菌发现,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)X8对维氏气单胞菌W1具有较强的抑制作用。     

紫菜腐霉拮抗菌的筛选和鉴定

生物防治广泛用于农作物的病害防治,该方法在藻类病害防控方面尚未有相关的报道。腐霉(Pythium sp.)是引起紫菜(Neopyropia)赤腐病(red rot disease)的主要病原,本研究的目的是筛选和鉴定对紫菜腐霉有拮抗能力的细菌。从养殖藻类及其养殖环境中分离鉴定了385株细菌,通过平板对峙法筛选到9株对腐霉有拮抗作用的细菌,进一步通过含毒介质法筛选到3株胞外产物对腐霉具有抑制活性的细菌(P3、P6和P19)。3株拮抗菌对8株腐霉均有拮抗活性,对腐霉生长的抑制率分别为52.09%~97.95% (P3)、26.81%~78.04% (P6)、10.47%~41.91% (P19)。通过16S rRNA鉴定和多位点序列进化分析(16S rRNA-dnaA-dnaN-recA),将P3和P6鉴定为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida),P19鉴定为解肽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas peptidolytica)。本研究筛选得到的拮抗菌为下一步建立紫菜赤腐病的生物防治方法奠定了基础。     

短小芽孢杆菌X93及胞外产物抑菌活性的研究

从健康养殖大黄鱼肠道中筛选出对病原弧菌有拮抗作用的潜在益生菌株X93,利用细菌快速鉴定系统和16S rDNA方法进行细菌种类鉴定;通过点种法对其抗菌谱进行测定;采用平板扩散法,研究了培养时间、温度、盐度、蛋白酶K和Fe3+等因素对其胞外产物抑菌活性的影响。结果显示:该菌株为短小芽孢杆菌(GenBank accession No.HM137033);对20株病原指示菌中的13株均产生不同程度的抑制作用,抗菌谱较广;菌株培养48 h后的胞外产物抑菌作用最强;在pH为7时,抑菌活性最大;达到最大抑菌活性的温度和盐度分别为28 ℃、5;蛋白酶K和不同浓度的FeCl3均会降低其抑菌活性。该菌对病原弧菌、迟缓爱德华菌和嗜水气单胞菌等水产上常见主要致病菌有良好的拮抗效果,且具有抑菌作用的胞外产物对温度、盐度和Fe3+有一定的适应范围,适宜作为益生菌株,有望在实际养殖环境中得到应用。     

弧菌拮抗菌的筛选及其效果

从健康的鱼虾体内以及养殖水体中分离得到 2 19株海洋细菌 ,以鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)、副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)、沙蚕弧菌 (Vibrioneresis)、飘浮弧菌 (Vibrionatriegen)等病原性弧菌为指示菌 ,在 2 2 16E平板上采用十字交叉划线法、点种法和平板扩散法进行体外拮抗实验 ,从中筛选到 6株有拮抗作用的海洋细菌。用平板活菌计数法研究拮抗菌J - 10及其胞外产物对鳗弧菌的抑菌作用 ;采用平板扩散法研究拮抗菌J- 10胞外产物抑菌效果的影响因子。结果显示 ,拮抗菌J- 10在混合体系中 ,2 4h之后表现出拮抗作用 ,在第 3天使鳗弧菌的数量降为最低 ,比第 1天的鳗弧菌数量下降了 2个数量级 ,之后鳗弧菌的数量开始上升 ,而对照组鳗弧菌的数量在第 2～ 5天基本维持第 1天的水平 ,表明拮抗菌J - 10在混合体系中具有较强的拮抗作用。拮抗菌J- 10的胞外产物能较好地抑制鳗弧菌的生长 ,使实验组的弧菌数量在 3h降为最低 ,之后呈缓慢上升的趋势 ,而对照组则一直呈上升的趋势 ;拮抗菌J - 10的胞外产物对热敏感 ,对pH的变化不敏感 ,对蛋白酶K不敏感 ,Fe3 的添加会减弱其抑菌活性。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定 ,J - 10为藤黄微球菌 (Micrococcusleteus)。     

嗜水气单胞菌拮抗菌的筛选

用平板划线法或点种法对212株分离自养殖水体和水产动物胃肠道的细菌进行筛选,得到1株对嗜水气单胞菌(Aerom onas hydrophila)有拮抗作用的细菌MLS-7。经过生理生化的初步鉴定,该菌为粪肠球菌(Entero-coccus faecalis)。MLS-7上清液抑菌试验和共培养试验表明其对嗜水气单胞菌有较强的抑菌作用。进一步对MLS-7抑菌谱进行测定,确认其对鱼源的病原菌有一定的抑菌作用。     

耐盐红螺菌拮抗物质的分离纯化及特性分析

耐盐红螺菌的无菌代谢产物经CM—Sephadex C-50弱阳离子交换色谱柱分离，获得3个蛋白吸收峰：PSB2-1’峰，PSB2—2’峰，PSB2—3’峰。其中PSB2-1’峰对病原菌具有拮抗作用。PSB2-1’峰组分样品经透析脱盐，后进行SDS—PAGE电泳检测，其冷冻干燥样品进行毛细管电泳与MALDI—TOF质谱鉴定，结果表明PSB2-1’峰的抑菌蛋白物质已达到较高纯度，其准确分子量为9290Da。耐盐红螺菌拮抗物质具有较好的热稳定性，对紫外线不敏感，但对酸碱性较敏感；用蛋白酶处理，其抑菌活性受枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响。耐盐红螺菌产生的拮抗物质可初步归属于小分子热稳定肽(SHSP)。     

稻鱼菜、稻鱼鸭复合生态模式综合效益的试验

试验研究和示范表明 ,与平作种稻比较 ,在稻鱼菜、鸭多元复合生态模式中 :水稻产量可平均增产 10 %以上 ,同时每亩平均增收鲜鱼 5 5 8kg ,成鸭 14 6kg ,蔬菜等经济作物 4 7 3kg (按稻田面积计算 ) ;提高了稻田的肥力 ,水稻土壤全N、P、K和有机质含量分别增加了 2 0 1%、 5 7 3%、 17 3%和 18 9% ;水稻植株虫口量最少。稻鱼菜、鸭多元复合生态模式的总收入达到 10 0 0元 /亩以上 ,大大提高了稻田的产出和效益 ;其生态环境质量指数在 0 5以上 ,属良性循环的高效多元复合生态农业模式。最后介绍了稻鱼菜、鸭多元复合生态模式的主要技术措施。