PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RTPCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2.重组质粒回收提纯后,以100 μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次.三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体.     

不同剂量猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗肌肉注射诱导仔猪细胞免疫的研究

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因疫苗(pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5)分别以200 ug,100 ug和50 ug 3种剂量肌肉注射免疫21日龄仔猪,同时设空载体对照和生理盐水空白对照.于免疫后7 d、15d、30d、45d、60d和70d采用流式细胞仪(FACS)和淋巴细胞增殖试验(MTT法)分别对免疫猪外周血中CIM+、CD8+T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行检测.结果表明3个不同剂量的pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫仔猪后均能诱导产生良好的细胞免疫应答,实验组与对照组比较差异极显著(p<0.01)或显著(p<0.05).大剂量基因疫苗免疫仔猪的外周血T淋巴细胞的增殖能力及CD4+、CD8+百分含量高于中剂量和小剂量基因疫苗免疫的仔猪,表现出一定的量效关系.     

Genetic analysis of ORF5 of recent Korean porcine reproductive and respiratory syndrome viruses (PRRSVs) in viremic sera collected from MLV-vaccinating or non-vaccinating farms

The 23 open reading frame (ORF) 5 sequences of Korean type II porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) were collected from viremic sera from the (modified live vaccine) MLV-vaccinating and non-vaccinating farms from 2007 to 2008. The samples were phylogenetically analyzed with previous ORF5 sequences, including type I Korean PRRSV, and previously reported or collected sequences from 1997 to 2008. A MN184-like subgroup of type II Korean PRRSV was newly identified in the viremic sera collected from 2007 to 2008. And of the type I PRRSVs, one subgroup had 87.2~88.9% similarity with the Lelystad virus, showing a close relationship with the 27~2003 strain of Spain. The maximum parsimony tree of type II PRRSV from 1997 to 2008 showed that they had evolved to four lineages, subgroups 1, 2, 3 and 4. Most of the recently collected type II PRRSVs belonged to subgroup 4 (48%). The region of three B-cell epitopes and two T-cell epitopes of ORF5 amino acids sequences was considerably different from the MLV in subgroups 3 and 4. In conclusion, the existence of type I PRRSV, which was genetically different from Lelystad virus (Prototype of type I PRRSV), and heterologous type II PRRSVs of viremic pigs detected even in the MLV-vaccinating farms indicated the need for new vaccine approaches for the control of PRRSV in Korea.     

多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析

为了解猪群中病毒性繁殖障碍疾病的流行状况,用多重PCR诊断方法,对太原市附近14个养猪场和门诊病例共1068份样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）的检测,其平均感染率分别为：PRRSV 32%、CSFV 40%、PPV 20%、PRV 12%、PCV-2 27%。其中混合感染2种病毒的猪群为39%,感染2种病毒的猪为24%。用RT-PCR试剂盒对山西省11个地市66个猪场及121个散养户的1572份血样进行了PRRSV和CSFV的检测,结果PRRSV感染率为33%,CSFV感染率为46%。用间接血凝试验对61个县38个乡136个村179户的1593份血样进行了猪瘟免疫抗体的检测,平均合格率为43.9%,从而为防控此类疫病的发生,制定综合防制措施提供试验数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制

为制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单克隆抗体,用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株免疫BALB/c小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,以有限稀释法克隆3次,制备单克隆抗体,并对制备的单克隆抗体进行鉴定。结果表明获得了2株分泌PRRSV膜基质蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1D12、5H5,经鉴定其抗体亚型分别为IgG2b、IgM,2株均为κ链,腹水ELISA效价分别为1∶107和1∶105。该单克隆抗体与PRV、PPV、PCV、CSFV、JEV无交叉反应。作者成功制备了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001～2007年分离自山东地区10株(ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析.结果表明:该10株病毒仍属北美洲型,其中2001～2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株(VR-2332株)和疫苗毒MLVRespPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006～2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ 、SD3,SD4,SD5, SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%～100%,99.4%～99.8%,99.2%～99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株(JXA1、Shanghai、HEB1)同属一个大的分支.首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势.     

PRV、PCV-2、PRRSV与HPs混合感染的核酸检测

为确定青海省某规模化发病猪场的发病原因,在临床诊断的基础上对采集的临床组织病料进行了13种常见病原体的核酸检测,并对检测结果进行了序列鉴定.结果表明,该发病猪场存在猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌的混合感染.研究结果提示,利用分子生物学技术对发病猪场的病原进行快速鉴定,是病源快速诊断和防控的有效途径.     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

【目的】 利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,并研究其免疫原性。【方法】 参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列（登录号：KT945017.1）,人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX （delta） E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID₅₀,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫效果。【结果】 PCR扩增出1条大小为400 bp的PRRSV N基因条带,测序结果正确,表明重组腺病毒构建成功,浓缩后测得其半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）为10^-10.239。RT-PCR和Western blotting检测结果证实目的基因在基因和蛋白水平上均可得到正确表达,蛋白分子质量约为14 ku。小鼠特异性抗体检测表明,重组腺病毒rAd-N免疫小鼠后可使小鼠快速产生PRRSV特异性抗体,与对照组差异显著（P<0.05）,其中重组腺病毒与Gel佐剂配合使用时效果最好,最高可达7.84 U/L。【结论】 本研究成功构建表达PRRSV N蛋白的重组腺病毒,其具有良好的免疫原性,为建立针对PRRSV抗体的间接ELISA检测方法和进一步研发PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。