一种用于板栗疫病菌基因打靶系统的新型抗性筛选标记

板栗疫病菌是研究病原真菌的模式物种之一。目前应用于板栗疫病菌遗传转化的筛选标记有潮霉素、苯菌灵和G418抗性基因。随着板栗疫病菌致病分子机理研究的深入,需要更多的遗传筛选标记用于多重基因的遗传转化分析。本研究通过融合PCR技术,成功利用博莱霉素抗性基因Bleor进行了板栗疫病菌高丰度分泌表达基因的打靶实验,证实了Bleor作为板栗疫病菌基因筛选标记的可行性。     

转基因猪研究新进展

由于猪既是重要的经济动物,又是常用的实验动物,并且因为其解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类相似,因此转基因猪的研究意义重大。纵观转基因猪的发展历史,关键核心技术包括显微注射技术、体细胞核移植技术、精子载体技术、胚胎干细胞介导技术、病毒转染技术、基因打靶、ZFN技术和TALENS技术。科学家们通过这些技术对猪进行了大量研究,已经在生命科学领域取得了令人欣慰的成就。     

CELⅠ酶的粗纯化及活性分析

TILLING（Targeting-induced local lesions in genomes）技术作为反向遗传学的一个重要研究工具，目前在众多的模式生物分子生物中得到广泛应用，其中CELⅠ酶是TILLING技术的核心。本实验通过硫酸铵沉淀、亲合层析、阴阳离子交换柱层析等常规的蛋白质纯化过程，从芹菜中粗纯化了具有较高活性的稳定的CELⅠ酶。并以杂合双链DNA为底物，对不同纯化程度的CELⅠ酶以及在不同温度、处理时间、有无Taq DNA多聚合酶的条件下进行了CELⅠ酶的错配切割活性分析。结果发现，所获得的CELⅠ酶得到了一定的纯化；CELⅠ酶的反应最适温度范围为40℃～50℃；长时间酶切特异性好；在含有Taq酶的酶切体系中，CELⅠ酶错配切割效果更佳，这与已报道的实验结果基本一致。与其他单位提供的CELⅠ酶活性相比，本实验分离纯化的CELⅠ酶活性值略高。通过对CELⅠ酶的提取及活性分析，为TILLING技术大规模和低成本的应用于家蚕功能基因组研究提供了保障。     

Where new farm woodlands support biodiversity action plans: a spatial multi-criteria analysis

In many developed countries forest cover is growing and the provision of non-market benefits is increasingly important for forestry management. The benefits provided by a new woodland not only depend on the design of the woodland (local site level), but also on its location in the wider landscape. This paper develops a generic GIS-based method to map the potential biodiversity benefits of new woodlands through an integration of species-habitat modelling for a list of 15 key species derived from a “Local Biodiversity Action Plan”, encompassing the Northeast of Scotland, and spatial multi-criteria analysis. For each selected species ‘Preferred Future Woodland’ maps are produced, indicating the extent to which populations of these species are expected to expand or contract in response to further afforestation. Species are then weighted on the basis of criteria of relative scarcity of suitable habitat and national importance of the regional population. The maps are then combined using this weighting to yield an overall potential biodiversity benefit map, which shows that the areas with the highest potential biodiversity gains are the edges of major agricultural areas (mostly deciduous), the riparian zones (deciduous) and areas adjacent to mature native pine woods (coniferous). It is demonstrated that the use of this map for more explicit spatial targeting of an existing farm afforestation scheme can help to provide much more ‘biodiversity value’ for taxpayers’ money.     

人c-myc乳腺定位表达转基因小鼠的建立

以含有 1.6 kb的小鼠乳清酸蛋白 (WAP)上游调序列的 p CAT- WAP和含有人 c- myc c DNA的 p WM为原始质粒 ,构建了 WAP启动子调控下的 c- myc乳腺定位表达载体 p WCS。载体用 Bgl Bam H 酶切 ,回收 3.5 kb的基因片段 WAP- c- myc- SV40 Poly A,通过显微注射方法导入 C5 7BL/ 6 J× DBA/ 2 JF1 代小鼠受精卵的雄原核内。共注射10 0 0枚卵 ,将存活的约 6 0 0枚卵分别移植至 2 9只假孕母鼠输卵管内 ,获得仔鼠 45只。PCR检测 ,阳性鼠 9只 ,South-ern blot检测 ,阳性鼠 3只 ,其中 1只母鼠 ,2只公鼠 ,在饲养过程中 ,1只母鼠意外死亡。对 2只转基因公鼠的 F1代PCR检测表明 ,仅 1只公鼠具有遗传性 ,在所生的 2 7只 F1代小鼠中有 13只为 PCR阳性。     

以重复序列为靶位点的鳜鱼多位点基因打靶载体的构建

以鳜鱼(Siniperca chuatsi)为研究对象，以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LA Taq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2，经T质粒克隆后，分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游，构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeo-HRDS1／2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向，最终构建成多位点基因打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2-hIFN。目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性等问题，以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题。     

绵羊FecB基因打靶载体构建

利用peGFP-C1,pRET.IL.PGK-TK和pMD19-T Simple等基本质粒,构建绵羊FecB基因打靶载体。以克隆载体pMD19-T Simple为载体骨架,插入一个正选择标记eGFP基因、一个负选择标记基因HSV-tk基因,并在eGFP基因两侧各添加一个同源长臂和同源短臂,从而构建绵羊FecB基因打靶载体。结果:经多个限制性内切核酸酶酶切鉴定和测序证实,所构建的基因打靶载体符合设计要求,表明成功构建了绵羊FecB基因打靶载体。     

靶向脂质体的超临界流体技术制作和表征

研究了超临界流体技术制备靶向脂质体的方法 ,将 SOD和磁性材料 Fe3 O4混溶后与卵磷脂充分乳化 ,经超临界 CO2 的溶胀沉析、真空冻干处理 ,获得 SOD靶向脂质体干品。当油水质量比为 7∶ 1,胆固醇与卵磷脂质量比为 1∶ 3,SOD与胆固醇质量比为 1∶ 10 ,SOD质量浓度为 0 .5 mg.m L-1时 ,靶向脂质体的包封率达到 96 ,包封比为 7.0 0 ,平均粒径为 3.85 μm,为多层脂质体。     

Applying Public Participation Geographic Information Systems to Wildlife Management

Wildlife management increasingly incorporates public participation to be more inclusive and reduce tensions between management and the general public in the decision-making process. There is also a need, however, to include spatial data since most wildlife biological and biophysical data are stored spatially in geographic information systems (GIS). This article presents a method for integrating this information using public participation geographic information systems (PPGIS). We asked stakeholders to identify specific places on a map that they would like to see maintained for the conservation of particular threatened species. This information is useful for identifying public wildlife management preferences and for allowing comparisons between public and expert opinions. We found high levels of public accuracy in identifying suitable habitat for threatened species conservation. We also identified places of potential conflict due to incompatible stakeholder preferences, but found little conflict between public conservation and development preferences.     

携带FAT1-FAT2基因打靶载体构建及其在猪肾细胞的表达与功能鉴定

【目的】ω-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)对人类具有重要的营养价值与医疗作用。随着生物技术的发展,通过转基因技术可实现哺乳动物体内自身合成多不饱和脂肪酸,进而改变猪肉中不饱和脂肪酸的含量和种类,对人类的营养健康具有积极意义。【方法】克隆猪体内缺乏的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因FAT1和Δ-12脂肪酸去饱和酶的关键基因FAT2,构建携带FAT1-FAT2双基因的多位点打靶载体。该载体以猪rRNA基因间的内部转录间隔序列为靶位点;为提高定点整合效率,引入NEO、TK正负筛选系统进行双重选择;加入EGFP报告基因和Cre/Loxp系统,便于筛选阳性同源重组细胞克隆及后期删除筛选基因。将所构建的携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体,通过脂质体介导瞬时转染猪肾细胞PK15。【结果】RT-PCR结果显示,FAT1-FAT2双基因在猪肾细胞PK15中实现表达;脂肪酸测定结果显示,ω-6 PUFAs、ω-3PUFAs在对照组PN1(转染对照质粒PN1)、转染试验组PF1(转染携带FAT1基因)、转染试验组PF1F2(转染携带FAT1-FAT2双基因)中的含量分别为7.9%、7.03%、3.92%和5.64%、7.01%、9.43%,差异均显著;ω-6/ω-3比例由对照组的1.4显著下降到试验组的0.42～1。【结论】构建携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体转染猪肾细胞PK15可以表达产生FAT1-FAT2 mRNA,且可以显著提高转染细胞中ω-3 PUFAs的含量,为下一步生产转FAT1-FAT2双基因猪奠定基础。