多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究

在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。     

莱航鸡rDNA重复基因家族的克隆

动物rDNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。通过结合生物信息学技术,经反复摸索后选用LAPCR法扩增莱航鸡rDNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了莱航鸡的3个rDNA基因及其2个间隔序列。研究对克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等进行了探索。     

观赏植物花色分子遗传学及基因工程研究进展

综述了观赏植物花色的分子遗传学及基因工程研究成果及进展，并展望了其发展前景。关于植物花色形成的影响因素及花色素苷的代谢途径研究较多，有许多与花色相关的结果基因和调节基因被克隆。目前花色基因工程主要采用的方法有反义RNA技术、共抑制法及导入新的目的基因等。     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

以重复序列为靶位点的鳜鱼多位点基因打靶载体的构建

以鳜鱼(Siniperca chuatsi)为研究对象，以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LA Taq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2，经T质粒克隆后，分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游，构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeo-HRDS1／2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向，最终构建成多位点基因打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2-hIFN。目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性等问题，以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题。     

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法，经反复摸索后选用LAPCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列，成功获得了全长2538bp，GC含量为65．7％的DNA序列，其中ITS1的GC含量高达80％．探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施．     

碧冬茄花特异表达基因启动子PchsA的克隆与序列分析

根据Ingrid M．报道的碧冬茄花特异表达基因CHSA启动子的序列设计并合成一对特异引物，以碧冬茄总DNA为模板，通过PCR扩增出约370bp大小的DNA片段，回收后克隆到pUCm—T质粒载体上，经转化、筛选确定重组子，酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序，得到片段长度为370bp．采用DSgene分析软件进行序列分析发现其基本具有启动子的所有保守序列，TATAbox，CCAATbox，Anther box，G—box，TACPyAT box，box1，box2，Capsite等，且经InternetBLAST程序和DSgene分析软件进行同源性对比和序列分析，显示序列与已报道序列同源性为96％，登陆GenBank，ID号为AY360358。     

生物信息学技术分析并克隆超级稻生长素结合蛋白cDNA

为进一步研究超级稻的生长素结合蛋白,采用生物信息学方法获得其全长cDNA序列,并进行分析;对全长序列进行了全长验证.从数据库搜索获得了一条水稻cDNA序列,含一个推测的206个氨基酸的开放阅读框,与其它植物的ABPIcDNA序列和ABPI蛋白质序列具有明显的同源性,并且其推测编码的蛋白质的各种性质,类似于其它植物的ABPI.结果显示,该序列为水稻的ABPIcDNA.以该序列为指导,利用RT-PCR扩增超级稻ABPlcDNA,并克隆测序,其序列与电子搜索结果一致.     

结核分枝杆菌疫源追踪的基因检测分析

目的探讨牛源性人结核疫源追踪的基因分析方法。方法采用复方PCR结核杆菌快速鉴定技术,针对特征性分枝杆菌标志基因(MTP40基因、α抗原基因和IS6110),对结核病人和患牛的标本,进行检测。结果患者标本结核分枝杆菌阳性;患牛标本牛分枝杆菌和结核分枝杆菌分别阳性。结论结核病奶牛不仅是人类牛型结核的可能来源,也可能成为人类人型结核的潜在来源。     

多位点基因打靶的定点整合效率研究

利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术.