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相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 73 毫秒
1.
【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素(Myostatin,MSTN)基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞(PK15细胞),用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。  相似文献   

2.
培养线虫(Caenorhabditis elegans),提取RNA并通过PT-PCR获得其ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1,整合入真核表达载体,构建了哺乳动物细胞表达载体pFat-IRES2-GFP,转染牛胎儿成纤维细胞系并对其进行G418筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染Fat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的HPLC分析结果表明,Fat-1基因已经整合入牛基因组中,并能够表达和发挥其ω-3脂肪酸脱氢酶的作用,促使-ω6PUFAs转变为相应的-ω3 PUFAs。ω-6脂肪酸总量从35.60%下降到25.47%,-ω3 PUFAs总量从5.75%上升到12.33%,多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.19下降到阳性细胞中的2.07,说明Fat-1基因整合是成功的,能够在细胞中以相应的-ω6 PUFAs为底物合成-ω3 PUFAs。  相似文献   

3.
【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。  相似文献   

4.
同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建   总被引:4,自引:1,他引:3  
李景芬  于浩  袁野  刘娣 《中国农业科学》2009,42(8):2972-2977
 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。  相似文献   

5.
【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因(ApoE)真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列(NM_214308)对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。  相似文献   

6.
【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因(ApoE)真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列(NM_214308)对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。  相似文献   

7.
【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。  相似文献   

8.
【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。  相似文献   

9.
【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。  相似文献   

10.
【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定。【结果】经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为18.2%;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为100%。【结论】MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出GGTA1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。  相似文献   

11.
潘丽红  周光宏  徐幸莲  彭增起 《安徽农业科学》2007,35(24):7610-7611,7613
为了研究如皋火腿中的酯类物质。选取7条4.5~5.0 kg如皋火腿为试材,用常规方法测定其理化指标(水分、盐分和pH值),通过气相色谱测定从提取脂质中分离的游离脂肪酸含量,并测定其共轭二烯值与羰基值。在如皋火腿股二头肌和皮下脂肪中含盐量为11.60%和1.07%,水分为40.21%和3.65%,pH值为5.71和6.02,游离脂肪酸含量为49.65%和26.11%,除pH外均存在极显著差异。如皋火腿中含有丰富的游离脂肪酸,在皮下脂肪中油酸的含量最多,股二头肌中亚油酸的含量最多。火腿中存在少量的反式脂肪酸,皮下脂肪有反式的油酸,股二头肌中有反式油酸、亚油酸和亚麻酸。股二头肌的氧化明显高于皮下脂肪,可能与酶活力、氧化方式有关。  相似文献   

12.
为了解广西核桃种仁含油率和脂肪酸组分含量差异,以巴马、凤山、天峨、南丹、乐业、田林、隆林等7个县份筛选的优树果实样品共计31个为研究对象,测定分析了果实含油率和脂肪酸组分含量。结果表明:种仁含油率为56.9%~65.1%,其中凤山004含油率最高,为65.1%,其次南丹004为64.1%,凤山002含油率最低。测定了广西不同产地核桃种仁的棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸和油酸等5种脂肪酸组分,其中棕榈酸含量在4.09%~8.36%,硬脂酸10.57%~45.09%、亚油酸45.88%~77.26%、亚麻酸3.16~10.28%、油酸0.3%~2.44%。以果实含油率及脂肪酸组成来评价不同产地核桃,为核桃产地的地区品牌打造的依据。  相似文献   

13.
脂肪酸是生物体的重要组成成分,对维持生物体的正常生命活动具有重要功能.在一些动植物或微生物中存在一些特殊脂肪酸,主要包括以下两类:一是通常在鱼油和海底微生物中发现的长链多不饱和脂肪酸,在医药保健业有重要应用价值;二是通常包含有羟基、环氧基或炔键等功能基团的脂肪酸,为重要的工业原料.本文综述了近年来几种特殊脂肪酸生物合成的基因工程研究进展.  相似文献   

14.
目的 探讨常见五种证型不同程度(轻度、中度和重度)脂肪肝与临床指标的关系。方法 选择2014年9月-2016年11月收治的脂肪肝患者208例,按照中医辨证分为肝郁脾虚证68例、湿浊内停证37例、湿热蕴结证47例,脾肾两虚证31例以及痰瘀互结证25例,同期选择健康对照组60例,比较轻度、中度、重度脂肪肝与中医证型之间的占比关系及相关生化指标与中医证型之间的联系。结果 脂肪肝程度从轻到重排序:肝郁脾虚证→湿热蕴结证→湿浊内停证→脾肾两虚证→痰瘀互结证。轻度脂肪肝湿浊内停证中TC、ALT指标外,其余生化指标与对照组比较均明显升高(P<0.05);四项生化指标(TC、TG、ALT、HOMA-IR)在各中医证型间比较也存在显著差异,痰瘀互结证、脾肾两虚证的TC、TG与其它三证型比较差异具有统计学意义(P<0.05),痰瘀互结证与TC(r=0.14,P=0.00)、TG(r=0.13,P=0.01)有显著相关性;痰瘀互结证、湿热蕴结证ALT升高较其他三证型明显,痰瘀互结证与ALT(r=0.11,P=0.02)有显著相关性;湿热内蕴型HOMA-IR较其它四证型升高明显,湿热内蕴证与HOMA-IR(r=0.14,P=0.02)有显著相关性;痰瘀互结证患者HGB指标有80%高于正常值,湿热蕴结证有72.34%高于正常值,与其它三证比较占比率上升。结论 脂肪肝中医证型与生化指标具有相关性,生化指标的检查结果能有效地帮助临床进行分型诊断,能够为患者病情的发展以及预后提供客观的指标。  相似文献   

15.
研究日粮添加不同脂肪酸混合物对泌乳奶牛血液脂肪酸组成及抗氧化性能的影响,选用36头健康的荷斯坦奶牛平均分为3个处理组,分别为对照组、长链脂肪酸组(LCFA)和中短链脂肪酸组(SMCFA),试验期8周,结果表明,泌乳奶牛日粮添加中短链脂肪酸可以显著降低血浆中碳链长度大于16的脂肪酸和总不饱和脂肪酸的含量(85.1%和87.94%;P〈0.05),显著提高血浆中碳链长度小于等于16的脂肪酸和总饱和脂肪酸的含量(14.86%和12.13%;P〈0.05)。同时,日粮添加中短链脂肪酸显著提高血浆中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比值(0.41%和0.36%;P〈0.05),显著降低了血浆中不饱和脂肪酸的含量(P〈0.05)。而日粮添加长链脂肪酸对血浆中各类脂肪酸含量影响差异不显著。试验结果还发现,日粮中添加中短链脂肪酸显著提高了血清中谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性(P〈0.05),降低了脂质过氧化产物丙二醛的含量,但没有达到显著水平。而日粮中添加长链脂肪酸也趋向于提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性,但只有谷胱甘肽过氧化物酶达到了显著水平(P〈0.05)。同时日粮添加长链脂肪酸显著提高了血清中丙二醛含量(P〈0.05)。结果显示,中短链脂肪酸较长链脂肪酸提高了血液的抗氧化性能,降低了脂质过氧化产物的产生,但是会提高血液脂肪酸的总饱和度。  相似文献   

16.
Five lactating Holstein cows in a 5×5 Latin square experiment were fed five high-concentrate total mixed rations(TMRs) to investigate the effects of step-wise improvement of forage combination on ruminal and milk fatty acid profiles. The ratio of concentrate to forage was fixed as 61:39, and the step-wise improvement of forage combination was applied as: TMR1, a ration containing corn stover; TMR2, a ration containing corn stover and ensiled corn stover; TMR3, a ration containing ensiled corn stover and Chinese wild ryegrass hay(Leymus chinensis); TMR4, a ration containing the ryegrass hay and whole corn silage; TMR5, a ration containing the ryegrass hay, whole corn silage and alfalfa hay. The TMRs were offered to the cows twice daily at 0700 and 1900 h. The entire experiment was completed in five periods, and each period lasted for 18 days. Diurnal samples of rumen fluids were collected at 0100, 0700, 1300 and 1900 h(day 16); 0300, 0900, 1500 and 2100 h(day 17); and 0500, 1100, 1700 and 2300 h(day 18). The step-wise improvement of forage combination increased energy and crude protein contents and decreased fibre content. As a result, the step-wise improvement of forage combination increased dry matter intake and milk yield(P0.05). The step-wise improvement increased dietary content of linolenic acid(C18:3 n-3), but did not alter dietary proportions of palmitic acid(C16:0), stearic acid(C18:0), oleic acid(C18:1 cis-9), linoleic acid(C18:2 n-6) and arachidic acid(C20:0). In response to the forage combination, ruminal concentration of C16:0, C18:2 n-6 and C18:3 n-3 linearly increased against their dietary intakes(P0.10). The step-wise improvement increased milk contents of C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C18:2 n-6 and C18:3 n-3(P0.10) and decreased milk contents of C18:0 and C18:1 cis-9(P0.05). Milk yields of C16:0, C18:1 cis-9, C18:2 n-6 and C18:3 n-3 were linearly increased by the increase of these fatty acids in the rumen(R2≥0.79, P0.05), and milk yields of C18:2 n-6 and C18:3 n-3 were also positively correlated with dietary intake of these fatty acids(R2≥0.85, P0.05). The step-wise improvement increased the transfer efficiencies from feed to milk for C18:2 n-6 from 11.8 to 14.2% and for C18:3 n-3 from 19.1 to 22.3%. In a brief, along with the step-wise improvement of forage combination, more dietary linoleic and linolenic acids might escape microbial hydrogenation in the rumen and consequently accumulated in milk fat though these fatty acids were present in low concentrations in ruminal fluids. The step-wise improvement of forage combinations could be recommended as a dietary strategy to increase the transfer efficiency of linoleic and linolenic acids from feed to milk.  相似文献   

17.
在人工氧化条件下,测定猪油、豆油、大豆粉、菜籽油、菜籽粉、江苏棉籽油、新疆棉籽油、罗非鱼油的酸价、碘值、过氧化值、丙二醛、脂肪酸组成。结果表明:①罗非鱼油所测定的氧化指标变化较其它油脂明显,其氧化稳定性最差;②猪油、罗非鱼油、棉籽油、菜籽油、豆油在氧化过程中过氧化值(POV)变化明显,应该成为油脂氧化程度评价的通用性指标;③大豆粉和菜籽粉的氧化指标变化最小,且其氧化稳定性明显好于相应的油脂;④0~70h内,随着氧化时间的延长,各油脂的脂肪酸组成有一定的变化。结论:在氧化过程中,不同种类油脂的氧化指标敏感度有差别,评价油脂氧化程度时应根据油脂种类选择氧化指标进行评价;在油脂氧化初期阶段,用脂肪酸的组成变化来表征油脂在氧化过程中品质的变化现象并不明显。  相似文献   

18.
植物常受到温度、盐和干旱等非生物以及病原菌和昆虫等生物胁迫。全面了解脂肪酸的去饱和、动员和调控将有助于提高植物对非生物和生物胁迫的耐受性。文章对近年植物脂肪酸在去饱和、动员和调控非生物和生物胁迫上的研究进展进行综述,并对脂肪酸去饱和酶的调控进行讨论。  相似文献   

19.
南疆巴旦杏与油料作物油脂及高级脂肪酸比较   总被引:5,自引:0,他引:5  
为探讨巴旦杏的脂肪酸含量及组成 ,以对其进行开发利用。采用超临界 CO2 萃取及索氏抽提的方法获得巴旦杏、油菜籽、花生、葵花籽、大豆、芝麻等 6种植物油的油样 ,并用气相色谱法测得其脂肪酸的含量及组分。结果表明 ,巴旦杏仁油不饱和脂肪酸含量较高 ( 93 .67% ) ,饱和脂肪酸含量较低 ( 6.3 3 % ,低于美国及加拿大标准 7.1 % ) ;不含能引起心血管疾病的豆蔻酸 ,且棕榈酸含量较低 ( 5.99% ) ;不含对人体无益的芥酸。从营养角度看 ,巴旦杏仁油不失为一种可供开发利用的新的植物油。  相似文献   

20.
[目的]探讨家蚕与其寄主植物体内脂质代谢的相互关系,为研究桑叶中营养物质含量对家蚕生长发育的影响提供参考。[方法]以家蚕品种NB4D2以及V-1、S-36、M-5 3种桑树品种的嫩叶、半成熟叶、成熟叶为研究对象;利用气液色谱法对桑叶中以及家蚕体内总脂以及脂肪酸含量进行分析;采用方差分析和多重比较方法进行数据处理。[结果]桑树嫩叶中油脂含量高于半成熟叶和成熟叶;嫩叶中脂肪酸前体含量较高,半成熟叶中不饱和脂肪酸含量较高,成熟叶中饱和脂肪酸含量较高;V-1桑树品种的叶面油脂含量高于S-36和M-5品种;V-1和S-36叶片中不饱和脂肪酸含量较高,M-5叶片中饱和脂肪酸含量较高;在蚕的血淋巴中没有发现月桂酸,但在其排泄物中含量较高;取食M-5叶片的蚕幼虫的血淋巴中棕榈酸和硬脂酸含量较高,而取食S-36和V-1叶片的蚕幼虫的血淋巴中亚油酸和亚麻酸含量较高,但桑树叶片中油酸和亚油酸比例是相互交替的;M-5叶片中油酸和亚油酸所占比例分别为1.93%和16.8%,而取食该品种叶片的蚕幼虫血淋巴中油酸和亚油酸所占比例则分别为21.5%和6.95%;取食S-36和V-1叶片的蚕幼虫血淋巴中油酸和亚油酸含量变化也有类似的转变。[结论]家蚕血淋巴、排泄物中油脂及脂肪酸的含量与桑树的品种及桑叶的成熟度密切相关,该研究结果对家蚕的育种与繁殖具有重要的指导意义。  相似文献   

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