莱航鸡rDNA重复基因家族的克隆

动物rDNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。通过结合生物信息学技术,经反复摸索后选用LAPCR法扩增莱航鸡rDNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了莱航鸡的3个rDNA基因及其2个间隔序列。研究对克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等进行了探索。     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法，经反复摸索后选用LAPCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列，成功获得了全长2538bp，GC含量为65．7％的DNA序列，其中ITS1的GC含量高达80％．探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施．     

以重复序列为靶位点的鳜鱼多位点基因打靶载体的构建

以鳜鱼(Siniperca chuatsi)为研究对象，以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LA Taq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2，经T质粒克隆后，分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游，构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeo-HRDS1／2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向，最终构建成多位点基因打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2-hIFN。目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性等问题，以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题。     

人类巨细胞病毒HCMV UL49区域一个新转录本的发现

将人类巨细胞病毒HCMVTowne株接种至人包皮成纤维细胞(HFF)中,收集病毒感染后的细胞,抽提病毒RNA,运用RT-PCR技术扩增基因的序列,对PCR产物作TA克隆,重组体进行测序和生物信息学分析。结果表明,HCMV的UL49区域存在一个新转录本,暂命名为UL49X。将所获得的序列与HCMV基因组比对分析表明,UL49X序列为68783bp到78608bp处的基因片段,并发现从69194bp到71530bp处有个典型的内含子。     

多位点基因打靶的定点整合效率研究

利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术.