两种一步法RNA提取试剂的比较

RNA的提取在生物医学研究和临床检测上应用广泛。本文分别用进口Invitrogen公司生产的以及我们自己研制的一步法RNA提取试剂，提取大肠杆菌RNA、鸡肌肉组织RNA和尿囊液RNA，通过核酸电泳和荧光定量RT-PCR进行比较。结果表明用我们自己研制的和进口的试剂提取的RNA都不含有DNA；这些RNA都可以作为模板进行RT-PCR检测，并且在数量上相互之间没有明显差异。说明我们自己研制的一步法RNA提取试剂可以取代进口试剂。此外，本文还讨论了此类试剂一些评定方法。     

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的 PCR扩增方法更为简便和快捷     

口蹄疫与经典猪瘟二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据口蹄疫病毒(FMDV)与猪瘟病毒(CSFV)基因组序列高度保守区,设计合成2对引物,以CSFV和FMDV培养物提取RNA并反转录,进行RT-PCR特异性片段扩增,扩增片段大小分别为200 bp、141 bp.结果表明,扩增产物与设计的2对引物之间的序列大小一致.通过特异性与敏感性试验,CSFV与FMDV培养物均可扩增至10-5倍稀释,最终建立的二联RT-PCR方法对上述2种病毒的敏感性亦可达10-4倍稀释,约10 pg的总RNA,证明本法对上述2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点.     

RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究

本试验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对猪瘟进行诊断应用研究.应用RT-PCR对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测,84份诊断为阳性,阳性率62.2%.从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共276份,经RT-PCR检测,37份为阳性,阳性率为13.4%.其中健康猪扁桃体带毒较高,246份扁桃体中有35份阳性,占14.2%.采自柳州健康猪的26份淋巴结材料全为阴性,只有邕宁县的1份健猪淋巴结阳性.结果表明,RT-PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断.     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT-PCR法,以1株h5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA.将cDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行测序.测序结果表明所克隆的1542个核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸.将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92.5%～95.9%,编码的氨基酸同源性为97.0%～98.4%.本研究通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系.     

鸡新城疫云南分离株HN基因序列测定和分析

用RT—PCR法对分离自云南省的2株鸡新城疫病毒(编号YN—C1、YN—C2)进行HN基因的扩增和克隆．并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明：2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为l716nt；二者之间的核苷酸同源性为95．3％，氨基酸同源性为95．8％；YN—C1毒株与参考毒株GD／1／98／Go核苷酸、氨基酸同源性均最高，分别为97．9％和97．6％；YN—C2毒株与参考毒株JS／5／01／Go核苷酸同源性最高为98．5％，而与参考毒株JS／3／98／Go氨基酸同源性最高为98．1%。     

种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.     

海河平原区棉花饲用黑麦复种方式及水肥利用效率分析

2011年10月-2014年10月连续3年在河北省任县安排了定位试验,通过饲用黑麦不同播期与棉花构建几种棉草复种茬口搭配方式,从产量、经济效益、水分利用效率和养分利用效率以及对土壤肥力影响等方面综合分析棉花饲用黑麦复种的可行性及复种方式。结果表明,棉花可与饲用黑麦复种,为降低饲用黑麦对棉花的影响,饲用黑麦可适当推迟到10月20日播种,次年4月底收获,效益可提高5470.1元·hm^-2。棉花饲用黑麦复种与棉花单作相比,平均水分利用率提高16.49%;水分经济利用效率提高56.54%;并且土壤有机质平均增长幅度提高5.71%,土壤含盐量平均降低幅度达到23.72%,土壤改良效果明显;是适用于该区域的高效复种模式。