来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

 应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I     

苹果果实中细胞质型苹果酸酶基因（NADP-ME）的克隆与表达分析

【研究目的】从苹果果实中克隆细胞质型NADP-苹果酸酶(NADP-ME)基因,并且从基因转录水平上研究该基因与苹果果实酸度的关系。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆NADP-ME基因,半定量RT-PCR分析该基因在高酸和低酸个体不同发育时期果实中的转录情况,并进行原核表达分析。【结果】成功克隆了细胞质型NADP-ME基因的cDNA全长序列,命名为Mal-ME(GenBank注册号:DQ280492);该基因表达一个约66kD的蛋白;半定量RT-PCR分析表明:不同发育时期的果实中Mal-ME的转录与苹果酸含量呈负相关,即随着Mal-ME转录水平的增强果实含酸量下降。【结论】成功从苹果果实中克隆了细胞质型Mal-ME基因,Mal-ME在果实发育过程中对苹果酸的积累起负调控作用。     

香蕉条斑病毒CP区基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

依据锌指结构在BSVCP上的可能位置合成了2条引物,通过PCR扩增得到长约640 bp的目的片段;将目的片段与质粒pET28 b(+)连接,构建了含BSVCP区基因的融合蛋白原核表达载体pET28b-BSVCP;克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),并诱导表达;经IPTG诱导后,出现一特异的约30 kDa融合蛋白质表达条带。     

SARS-CoVS基因重组质粒的构建与瞬时表达

根据GenBank中登录的SARS-COV（BJ01株）基因序列设计引物，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从SARS病毒中扩增得到约3768bp的片段，将其克隆到真核表达质粒pVAX1，鉴定正确后．命名为pVAX1／S。体外转染Hela细胞．间接免疫荧光鉴定S蛋白的表达。构建的重组质粒经酶切及测序鉴定．开放阅读框正确；间接免疫荧光方法鉴定该重组质粒能在Hela细胞中表达。     

兔防御素基因在毕赤酵母中的串连表达及抑菌机理研究

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性重编兔防御素基因(Neutrophils peptide-1,pNP-1),设计4条引物搭桥合成.将pNP-1克隆到pPICZα-A载体,使用同尾酶Xho Ⅰ和SalⅠ在重组载体上构建多价串联体[pNP-1(2×)]和[ pNP-1(3×)],分别对这3个基因进行毕...     

沙冬青GATA型锌指蛋白基因序列及表达分析

根据沙冬青低温干旱诱导cDNA文库表达序列标签中锌指蛋白基因序列设计特异引物,采用PCR技术扩增锌指蛋白基因AmZFPG的cDNA全长.序列分析表明,cDNA全长669 bp,推测编码223个氨基酸残基、分子量约25 kD的蛋白质.氨基酸保守性分析及同类锌指结构比对表明AmZFPG属于GATA结合蛋白家族,且具有高度的...     

UK114基因的克隆和表达载体的构建

本研究采用PCR法扩增得到重组UK114 cDNA序列,将其克隆于T-easy载体并进行了序列测定与分析。结果表明该序列全长1 017 bp,有一个开放的阅读框(40 nt~450 nt),可编码137个氨基酸(14.2 kDa),与UK114的序列比较,同源性为91%,突变的86个核苷酸中都为无义突变,开放阅读框中仅有一个核苷酸突变。此外,本实验构建了pBV114表达载体,选择阳性克隆提取质粒进行酶切,琼脂糖检测获得约1 kb和3.7 kb的两个片段。     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得不含有信号肽序列的phyC基因表达片段,亚克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K的多克隆位点,并电转化毕赤巴斯德酵母GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子PP9KC.首次在毕赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽孢杆菌植酸酶的分泌表达,去糖基化试验表明该植酸酶的分子量为53.5 kD和50.9 kD糖基化程度不同的两种糖蛋白.用麦芽汁半合成培养基对PP9KC进行诱导培养,培养48 h后酶活可达到2453 U/mL,表达量为出发菌株的10.5倍.酶学性质分析表明,其酶促反应最适pH值为7.0,最适反应温度为65℃,经90℃处理10 min,残留酶活性为37℃时的78.2%.     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因，将其连接到克隆载体pMD18-T上，经测序鉴定正确后，再克隆到原核表达载体pET-41a（＋）上，构建重组表达质粒pET-EGF．用重组质粒转化Ecoli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting对GST—EGF融合蛋白进行分析，结果表明37℃诱导表达的融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的20．2％；30℃诱导表达的可溶性融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的7．7％．