牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针，摸索其最佳反应条件，进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性，最低检出限度为8.26×10¹拷贝/μL，在8.26×10³～8.26×10⁸拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系，同时不与其他致病菌发生交叉反应，组间及组内的变异系数均小于4%，应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品，与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。     

猪SENP1基因克隆、生物信息学分析与表达研究

试验旨在对猪SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease 1,SENP1)基因CDS区进行克隆和生物信息学分析,并探讨SENP1基因在乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染PK15细胞后的表达情况。根据GenBank中公布的猪SENP1基因预测序列(登录号:XM_013997974.2)设计特异性引物,通过RT-PCR和T/A克隆技术对猪SENP1基因CDS区序列进行克隆测序,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR分析猪SENP1基因在JEV感染PK15细胞不同时间点(0、12、24、36、48 h)的表达情况。结果显示,猪SENP1基因CDS序列全长2 034 bp,共编码677个氨基酸。序列比对和系统进化树分析结果表明,猪SENP1蛋白序列和山羊、犬、人、牛的相似性分别为94.8%、94.2%、93.9%和93.8%,说明在这些物种中SENP1的保守性较强;猪与犬的SENP1分子亲缘关系较近。生物信息学分析结果显示,猪SENP1蛋白相对分子质量为76 825.76,等电点为8.53,体外半衰期为30 h,不稳定系数为53.59,总平均亲水指数为－0.622。SENP1蛋白不含信号肽序列,无跨膜结构域。二级结构分析结果显示,SENP1蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占31.31%、46.68%、16.25%和5.76%。三级结构分析结果显示,猪SENP1蛋白中存在8个α-螺旋区和7个β-转角区。实时荧光定量PCR结果显示,猪SENP1基因在JEV感染的PK15细胞中呈现上调表达趋势,其中在感染后48 h SENP1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。本试验结果为后续深入研究SENP1基因功能提供了参考。     

蓝光对滇重楼生长及光合作用的影响

[目的]研究不同波长(410、440、450、460和485 nm)蓝光对滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)生长及光合作用的影响。[方法]以3年生滇重楼种苗为试材,测定不同波长蓝光处理3个月后的光合参数、叶绿素荧光参数及生长指标等。[结果]410和485 nm蓝光处理下滇重楼潜在光合能力和长势较差,440 nm蓝光处理下净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)和蒸腾速率(T_r)均最高,全株鲜质量较初始鲜质量增加比例最高,而胞间CO_2浓度(C_i)较低,且光系统Ⅱ的最大光合效率(F_v/F_m)低于正常范围,非光化学猝灭参数(NPQ)较低,说明该波长蓝光处理对滇重楼造成光胁迫;440 nm蓝光处理下滇重楼叶绿素a及叶绿素(a+b)含量均最高,叶绿素b含量较高,仅次于450 nm蓝光处理。[结论]440 nm蓝光处理下滇重楼叶片光合能力较强,有利于其鲜质量增加和光合色素含量的累积。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

鱼肠道弧菌免疫检测方法的研究

采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。     

H7亚型禽流感病毒核酸标准品制备及双探针荧光RT-PCR检测研究

从禽流感病毒A/Chicken/1/2002(H7N1)核酸中扩增了完整HA的基因编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备c RNA。用RNA保存液稀释至含量约108Copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过8家实验室联合定值,取平均值作为定值结果;经统计分析计算了该标准品的不确定度。此外,采用Taq Man方法,根据禽流感病毒H7亚型的血凝素基因的末端,采用1对引物和2条MGB探针,建立了禽流感病毒H7亚型Taq Man荧光RT-PCR快速检测技术。应用建立的方法对研制的标准品进行检测,检测限可达10基因拷贝;对新城疫病毒及其他亚型的流感病毒核酸进行检测,结果表明,建立的方法特异性良好,而且双探针的设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。     

双芽巴贝斯虫TaqMan实时荧光PCR检测方法的建立

根据双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)18SrRNA基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,建立了检测双芽巴贝斯虫的实时荧光PCR方法。该方法灵敏度高,最小检出量为1.1×101 copies/μL的标准质粒,比常规PCR灵敏1 000倍;重复性好,组内和组间重复性试验的变异系数分别为0.21%¹.14%和0.31%1.14%和0.31%¹.50%,均小于2%;特异性强,对牛常见的其他两种血液原虫和健康血液无交叉反应。用建立的实时荧光PCR和常规PCR分别对30份临床样品进行检测,实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为30%和16.7%。结果表明,本研究建立的荧光TaqMan实时荧光PCR方法可以灵敏、准确、快速检测双芽巴贝斯虫感染,将为蜱传牛梨形虫病的流行病学调查和防制提供新的方法。     

叶面肥对‘巨峰’葡萄光氧化胁迫的缓解效应

【目的】探究光氧化胁迫条件下叶面肥对葡萄叶片的保护及缓解效应。【方法】以设施栽培的‘巨峰’葡萄为试材,叶面喷施CaCl_2、NaHSO_3、氨基酸钙叶面肥、氨基酸钙叶面肥+NaHSO_3,然后叶片涂抹甲基紫精(MV)模拟光氧化胁迫,研究叶面肥对光氧化条件下葡萄叶片的光合、荧光参数、超氧阴离子(O_2~)产生速率、H_2O_2含量及MDA含量等的影响。【结果】叶片涂抹MV后发生光氧化胁迫,各处理的相关指标均发生改变,其指标表现均不如仅喷清水的对照,但与喷清水+MV处理相比,喷施叶面肥处理指标变化幅度均变小,不同程度地缓解了光氧化对葡萄叶片的伤害。喷清水+MV处理的净光合速率(P_n)下降幅度最大,比清水对照下降了47.9%,喷施氨基酸钙肥600倍液以及氨基酸钙肥600倍液+NaHSO_3的效果好,P_n下降幅度小,分别比喷清水+MV处理的低34.8个百分点和33.7个百分点,差异显著;气孔导度(G_s)变化趋势同P_n。初始荧光(F_0)指标,喷清水+MV处理增幅最大,为22.0%;喷施氨基酸钙600倍液+NaHSO_3处理的增幅最小,为5.1%,比前者低16.9个百分点;最大荧光F_m、PSⅡ最大光化学效率F_v/Fm、F_v/F_0、实际光化学效率Φ_(PSⅡ),喷施叶面肥处理下降幅度均小于喷清水+MV处理。各处理的超氧阴离子(O_2~)产生速率、H_2O_2含量、MDA含量增加幅度不同,其中喷清水+MV处理增加幅度最大,分别为56.0%、83.8%、34.8%;喷施叶面肥处理增加幅度均变小,其中喷施氨基酸钙600倍液+NaHSO_3处理的增加幅度最小,分别为19.4%、15.1%、0.99%,明显减轻了光氧化胁迫。【结论】综合各项指标,喷施叶面肥对葡萄光氧化胁迫有明显的缓解效应,以喷施氨基酸钙600倍液+NaHSO_3效果最好,建议在生产中选择应用。     

蛹虫草CmKexin基因克隆和菌丝体中表达检测

为了探讨蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)的表达特性,以真菌蛹虫草菌丝体为研究对象,通过RT-PCR获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列,并进行序列分析。应用Northern杂交和Real-time PCR方法,检测蓝光照射后蛹虫草菌丝体中CmKexin基因的转录情况。结果获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列。对翻译蛋白质产物CmKexin进行生物信息学分析,表明该蛋白质含1个属蛋白转化酶的肽酶S8家族功能域(143~429)和1个前体蛋白转化酶P功能域(514~600),符合真菌类枯草杆菌蛋白酶的特征。蛹虫草菌丝体在黑暗预培养4 d后再蓝光照射,Northern Blotting和Real-time PCR检测均可得到相同的结果,即在持续的蓝光照射48~50 h时,出现CmKexin基因的瞬时大量转录。而其他时间内均未检测到该基因的大量转录。试验结果将为蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶的利用提供理论依据。     

核酸适体检测赭曲霉毒素A荧光方法的建立

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)普遍存在于谷物等粮食和动物饲料中,是一种可以引起癌症的霉菌毒素。为了快速检测OTA,利用荧光染料PicoGreen识别双链DNA原理,建立了一种基于核酸适体与PicoGreen检测毒素OTA的方法。在10 mmol/L Tris,120 mmol/L Na Cl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH8.5)缓冲液中,PicoGreen与双链DNA结合后,释放的荧光在3 min内达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。从加样到荧光检测,整个流程可在40 min内完成。检测OTA的灵敏度为1μg/L;检测范围为1μg/L~200μg/L。特异性实验表明:OTA核酸适体-Pico Green方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法在检测敏感性和特异性方面与传统抗体ELISA方法相当(Kappa值为:0.857)。由于核酸适体成本比抗体低,因此本方法比抗体ELISA方法更具实用价值。