猪ASB2基因CDS区克隆、生物信息学分析及表达规律研究

本研究旨在克隆猪锚蛋白重复序列和细胞信号抑制因子盒蛋白2（ankyrin repeat and suppressor of cytokine signalling box containing protein 2,ASB2）基因完整CDS区序列,通过生物信息学方法分析CDS序列和蛋白质基本特性,探讨其在晋汾白猪不同组织及卫星细胞诱导成肌过程中的表达规律。选取1日龄晋汾白猪为研究对象,依据GenBank中猪ASB2基因预测核苷酸序列设计引物,以背最长肌组织cDNA为模板,采用分段扩增法进行猪ASB2基因的克隆。利用生物信息学软件分析ASB2氨基酸序列及编码蛋白质的结构和功能,利用实时荧光定量PCR技术检测ASB2基因在猪不同组织及卫星细胞诱导成肌过程中的表达水平。结果显示,猪ASB2基因完整CDS区序列长1 824 bp,共编码607个氨基酸。猪ASB2基因核苷酸序列与山羊和牛的相似性最高。生物信息学分析发现,ASB2蛋白为亲水性蛋白,共有54个磷酸化位点,11个O-糖基化位点,1个N-糖基化位点,没有信号肽。保守结构域分析结果表明存在11个ANK基序和1个SOCS基序。猪ASB2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链分别占43.99%、40.36%、10.05%和5.60%。实时荧光定量PCR结果显示,ASB2基因在猪腰大肌组织中表达量最高,其次为背最长肌和心脏,且与其他组织中表达量具有极显著差异（P<0.01）;在诱导卫星细胞成肌过程中发现该基因表达量呈先升高后降低趋势,提示其可能参与调控肌肉生长过程。本研究结果可为进一步探讨猪ASB2基因功能及作用机制提供参考依据。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

绵羊CREBRF基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对绵羊Luman/CREB3募集因子(CREBRF)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在绵羊不同组织中的表达量,为探究CREBRF基因在绵羊中的生物学功能提供理论参考。【方法】 以绵羊卵巢cDNA为模板,通过PCR扩增和克隆绵羊CREBRF基因完整CDS区序列,并进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测CREBRF基因在绵羊不同组织中的表达水平。【结果】 绵羊CREBRF基因CDS区序列全长1 920 bp,编码639个氨基酸。相似性比对结果表明,绵羊CREBRF氨基酸序列与山羊、牛、人、小鼠、猪、犬、马、鸡、鸭和斑马鱼的相似性分别为99.8%、99.1%、95.4%、93.6%、98.3%、97.5%、98.4%、88.0%、87.5%和61.3%。系统进化树分析结果显示,绵羊与山羊、牛的亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。生物信息学分析发现,绵羊CREBRF蛋白分子式为C₃₁₂₆ H₄₉₁₄ N₈₅₈ O₁₀₅₆ S₂₁,分子质量为72.08 ku,等电点(pI)为4.77,半衰期为30 h,肽链N-端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为54.83;CREBRF蛋白存在于细胞核内,不具备跨膜性,无信号肽,为亲水性不稳定蛋白。CREBRF蛋白二级结构主要以无规则卷曲(47.57%)为主,其次为α-螺旋(37.09%)。实时荧光定量PCR结果显示,CREBRF基因在绵羊不同组织中均有表达,其中在心脏、肾脏和卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】 本试验获得了绵羊CREBRF基因CDS区全长序列,并初步研究了其组织表达规律,为研究绵羊胚胎发育的调控机制及提高繁殖力等提供了材料。     

猪MORC2基因克隆、生物信息学分析及组织表达定位

【目的】克隆猪的Microrchidia家族CW锌指蛋白2（Microrchidia family CW-type zinc finger 2,MORC2）基因,利用生物信息学手段分析其序列特征,并检测MORC2基因在猪不同组织中的表达情况和卵巢中的定位。【方法】以猪卵巢cDNA为模板扩增和克隆MORC2基因完整CDS区,并进行相似性比对及系统发育树构建;利用生物信息学软件对猪MORC2蛋白序列进行预测;使用实时荧光定量PCR检测MORC2基因在猪不同组织中的表达情况;利用免疫组化方法检测猪MORC2蛋白在猪卵巢中的定位情况。【结果】猪MORC2基因CDS区序列全长3 102 bp,编码1 033个氨基酸。猪MORC2蛋白氨基酸序列与人、黑猩猩、恒河猴、小鼠、牛、绵羊、鸡和斑马鱼的相似性分别为94.8%、94.6%、94.9%、91.9%、93.8%、93.9%、80.8%和64.3%。系统进化树表明,猪与灵长类亲缘关系最近,与反刍动物和啮齿类次之,与斑马鱼（鱼类）亲缘关系最远。猪MORC2蛋白分子质量为117.44 ku,理论等电点为8.16,半衰期为30 h,属于不稳定蛋白。MORC2蛋白的平均疏水性为―0.736,为亲水性蛋白,不含跨膜结构和信号肽。猪MORC2蛋白有174个磷酸化位点、81个糖基化位点;亚细胞定位属于核蛋白,细胞质次之,线粒体中有少量表达;含有经典的MORC蛋白家族结构：GHKL-ATPase、zf-CW和CC结构域。组织表达谱结果显示,MORC2基因在猪各组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最多,显著高于其他组织（P＜0.05）,在心脏、肺脏和肌肉中表达量较少,显著低于其他组织（P＜0.05）。免疫组化结果显示,MORC2蛋白在健康猪卵泡颗粒细胞和膜细胞中均有表达且表达量较高,在闭锁的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达量较少。【结论】试验成功获得猪MORC2基因完整CDS区序列,该基因在猪各组织中广泛表达,MORC2蛋白主要在健康猪的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达。研究结果为进一步研究MORC2蛋白调控猪卵巢发育和卵泡闭锁的分子机制提供理论依据。     

广灵驴CAPN1基因克隆、生物信息学分析及表达研究

本研究旨在对钙蛋白酶1（CAPN1）基因CDS区进行克隆及生物信息学分析，并鉴定其在广灵驴各组织中的表达量。应用生物信息学方法对广灵驴CAPN1基因CDS区进行序列分析，并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰结构和蛋白结构进行预测；利用实时荧光定量PCR技术对CAPN1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6种组织中的表达水平进行分析。结果显示，广灵驴CAPN1基因CDS区全长2 148 bp，可编码715个氨基酸，已提交至NCBI，登录号为：MN158194，其核酸序列与马、绵羊、牛、人、山羊、小鼠、猪的同源性分别为99.7%、92.3%、92.5%、92.0%、92.5%、85.9%和92.9%；CAPN1蛋白的分子质量为82.01 ku，理论等电点为5.59，平均疏水性为-0.374，不稳定系数为36.42，不存在跨膜区及信号肽；其编码蛋白的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链组成；CAPN1基因在广灵驴的6种组织中均表达，其中在背最长肌中的表达量最丰富，其次是肝脏，在心脏中的表达最低。本研究成功克隆了广灵驴CAPN1基因CDS，并对其在不同组织中的表达量进行了分析，为进一步研究CAPN1基因在肌肉嫩度方面的表达调控功能及发展地方品种广灵驴肉制品产业提供了理论依据。     

猪CCAR1基因细胞定位、表达特性及对细胞增殖的影响

旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列，研究其亚细胞定位和表达特性，探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区，通过测序和序列拼接获得完整CDS区；采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位；采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的时空表达规律；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCAR1基因，通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8（cell counting kit 8）技术检测CCAR1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明，猪CCAR1基因的完整CDS区长3 459 bp（MH301308.1），在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达。大白猪和马身猪不同组织CCAR1的表达谱基本相似，在所检测的组织中均有表达，均表现为在肾和小肠中表达量最高，在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达，在心和皮下脂肪中低表达；CCAR1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达。CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCAR1的表达，在转染48 h后，相比于对照组，试验组都对细胞增殖产生极显著抑制（P<0.01）；CCAR1基因敲除后，细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降（P<0.05），Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降（P<0.05），Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达，可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖，在猪的生长发育过程中起重要作用。     

山羊干扰素刺激基因15克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

【目的】对山羊干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)的CDS区进行克隆、表达和生物信息学分析,并探讨小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染山羊子宫内膜上皮细胞(caprine endometrial epithelial cells,EEC)对ISG15的影响。【方法】根据GenBank中公布的山羊ISG15基因预测序列(登录号:XM_005690795)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增山羊ISG15基因CDS区,连接至真核表达载体进行测序并表达,对不同物种ISG15核苷酸及氨基酸序列进行比对,并构建系统进化树,利用生物信息学方法对ISG15蛋白理化性质、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、亚细胞定位等进行分析。通过构建真核表达载体转染及PPRV感染EEC细胞,利用间接免疫荧光的方法观察其外源性和内源性亚细胞定位,并探究PPRV感染对EEC细胞的影响。【结果】成功克隆出山羊ISG15基因CDS区并进行了真核表达。山羊ISG15核苷酸和氨基酸相似性及进化树分析都与盘羊和绵羊亲缘关系最近。生物信息学分析结果显示,山羊ISG15基因位于16号染色体上,全长474 bp,编码157个氨基酸,分子质量约为17.47 ku,为亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,有1个潜在的N-糖基化位点,16个潜在的O-糖基化位点和10个潜在的磷酸化位点。二级结构与三级结构预测显示,山羊ISG15蛋白由无规则卷曲、延伸链、α-螺旋和β-转角组成,比例分别为34.39%、31.21%、21.66%和12.74%。可以与干扰素和泛素化相关的蛋白相互作用,并参与机体的抗感染作用。亚细胞定位显示,外源性和内源性ISG15均定位于细胞质中。【结论】试验成功克隆出山羊ISG15基因CDS区序列,亚细胞定位发现内源性和外源性ISG15均定位于EEC细胞的细胞质中。结果为后续ISG15基因细胞内功能研究奠定基础。     

小尾寒羊SPARCL1基因编码区克隆及表达分析

为了探究小尾寒羊富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似物1（secreted protein acidic and rich in cysteine like 1,SPARCL1）基因结构及其各组织间表达差异,试验提取小尾寒羊肝脏组织总RNA,根据GenBank中公布的绵羊SPARCL1基因序列设计引物,应用PCR技术扩增SPARCL1基因编码区（CDS）。将扩增产物连接到pMD18-T载体进行测序,获得小尾寒羊SPARCL1基因完整CDS区序列信息,应用生物信息学软件分析序列及蛋白结构。以小尾寒羊心脏、肝脏、肌肉、胃、十二指肠、小肠组织mRNA为模板,通过实时定量荧光PCR技术检测SPARCL1基因在小尾寒羊各组织间的表达差异。结果显示,试验成功获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS 1 962 bp,编码653个氨基酸;分子质量为74.39 ku,理论等电点为4.64,为亲水性蛋白质;SPARCL1基因具有信息肽切割位点,为分泌蛋白;小尾寒羊SPARCL1基因序列与NCBI中绵羊序列同源性为99.80%,SPARCL1基因CDS区出现4处突变位点,但未引起氨基酸改变;SPARCL1蛋白存在77个蛋白磷酸化位点和3个糖基化位点;SPARCL1蛋白表达预测主要定位在细胞质;SPARCL1蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占31.9%、6.4%、28.7%和33.0%,三级结构预测结果与其一致。SPARCL1基因在小尾寒羊皮下脂肪组织中相对表达量明显高于其他组织。本研究成功克隆获得小尾寒羊SPARCL1基因CDS区完整序列,并对其序列、蛋白理化特性、结构及各组织间表达差异进行了详细分析,为研究小尾寒羊SPARCL1基因功能,探究其在小尾寒羊脂肪代谢过程中可能发挥的作用提供参考依据。     

陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

试验旨在了解陆川猪丙酮酸脱氢激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）基因CDS区序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建PDK4基因的真核表达载体,分析PDK4基因在陆川猪不同组织中的表达情况,以期为阐明PDK4基因在陆川猪生长发育过程中的分子机制奠定基础。采用RT-PCR技术扩增陆川猪皮下脂肪PDK4基因CDS区,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能,并利用常规分子克隆技术将其插入真核表达载体中获得pEGFP-N1-PDK4,用脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞并观察荧光,用实时荧光定量PCR检测PDK4基因mRNA在陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪中的表达情况。结果显示,陆川猪PDK4基因CDS区全长1 224 bp,编码407个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PDK4基因CDS区同源性达99.8%。对陆川猪PDK4基因所编码的蛋白进行生物信息学分析发现,其分子质量约为46.144 ku,原子总数为6 509个,理论等电点（pI）为7.21,带正电荷和负电荷的氨基酸数均为42个。PDK4蛋白可能有2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点。亚细胞定位结果发现,PDK4蛋白有34.8%存在于线粒体,30.4%存在于细胞质,26.1%存在于细胞核,质膜和液泡膜各占4.3%。细胞试验发现,对照组和试验组均发出荧光,相较于对照组,试验组中PDK4表达量极显著升高（P<0.01）,PDK4基因在皮下脂肪中表达丰度最高,随之为肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,在背最长肌中表达量最低,而且在皮下脂肪中的表达量极显著高于背最长肌（P<0.01）。本试验成功扩增出PDK4基因CDS区并构建了真核表达载体,成功对其结构和功能进行预测分析,为研究陆川猪皮下脂肪沉积的遗传改良提供了参考依据。     

广灵驴HSL基因克隆、序列分析与差异表达

试验旨在对广灵驴的激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase，HSL）基因进行克隆和序列分析，并对HSL基因在广灵驴不同组织中的差异表达水平进行分析。使用RT-PCR法扩增并克隆广灵驴HSL基因CDS区部分序列，将序列拼接后得到HSL基因完整的CDS区全长序列，并对序列进行一系列生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR检测HSL基因mRNA在广灵驴的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪7个组织中的表达情况。结果显示，广灵驴HSL基因完整的CDS区全长为2 286 bp，共编码761个氨基酸，序列已提交到NCBI，登录号：MN231003。广灵驴HSL基因的核苷酸序列与马、羊驼、骆驼、猪、牛、山羊、小鼠、绵羊相应序列的同源性分别为99.6%、88.9%、88.6%、88.1%、86.9%、85.6%、80.8%、79.1%。系统进化树预测表明，广灵驴HSL基因与马的亲缘关系最近，与小鼠的亲缘关系最远。生物信息学分析发现，HSL蛋白的理论等电点为6.51，不稳定指数为56.83，亲水性的总平均值为-0.048，说明HSL是酸性不稳定的水溶性蛋白。蛋白保守域中存在N-末端结构域、α/β水解酶折叠结构域以及调节结构域。蛋白序列中共存在88个磷酸化修饰位点、25个糖基化修饰位点。蛋白中存在较强的疏水性区域，没有信号肽及跨膜区域。二级结构显示此蛋白是由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成的，分别占45.33%、11.70%、5.65%、37.32%。实时荧光定量PCR检测结果显示，HSL基因mRNA在广灵驴的7种组织中均有表达但存在差异，在皮下脂肪中表达量最高，在心脏中表达量最低，说明广灵驴HSL基因可能在体内脂肪沉积中发挥着非常重要的作用。该试验为进一步研究HSL蛋白功能及其在广灵驴脂肪沉积中代谢调控机制提供了理论基础。     

绵羊PDGFD基因克隆及其在不同部位脂肪组织中的表达

试验旨在获得绵羊血小板源性生长因子D （PDGFD）基因的编码区（coding sequence，CDS）全长序列，并了解其在体内不同部位脂肪组织中的表达规律。以阿勒泰母羊和中国美利奴母羊为研究对象，克隆获得了PDGFD基因CDS区全长序列并对其进行了生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR方法对PDGFD基因在2个品种羊沉积在尾部、肠系膜、背部和肾脏周围4个不同部位脂肪组织中的表达水平进行定量分析。结果显示，绵羊PDGFD基因CDS区序列长度为1 113 bp，编码370个氨基酸；PDGFD基因CDS区序列及其编码序列与山羊的相似性最高，其次是牛、猪、马、人，与鼠的相似性最低，系统进化树分析结果与其一致；预测PDGFD蛋白属于稳定的亲水性蛋白，且无跨膜区，存在信号肽序列，属于分泌型蛋白；PDGFD蛋白含有1个糖基化位点、1个CUB结构域和1个PDGF结构域，PDGFD蛋白二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲构成，三级结构与结构域和二级结构分析结果基本吻合。实时荧光定量PCR结果显示，PDGFD基因在阿勒泰羊4个脂肪组织的表达量均高于中国美利奴羊，其中阿勒泰羊尾脂和背部脂肪的表达量显著高于中国美利奴羊（P<0.05）。本研究结果为进一步探究PDGFD基因在绵羊脂肪沉积中的作用机制提供参考。     

金华猪PPARGC1A基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α（PPARGC1A）在金华猪和大白猪中的遗传特征和表达情况，探究PPARGC1A基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达模式。以金华猪和大白猪为试验动物，分别提取背脂组织的总RNA，根据GenBank中公布的猪PPARGC1A基因序列（登录号：NM_213963.2）设计编码区和实时定量PCR引物，以猪GAPDH基因和β-actin蛋白作为内参，应用多种生物信息学方法对PPARGC1A基因编码蛋白进行功能分析，并通过实时荧光定量PCR及Western blotting检测其在金华猪背脂中的表达水平。结果表明，金华猪PPARGC1A基因CDS区全长2 361 bp，编码786个氨基酸，该蛋白分子大小90 336.01 u，其中丝氨酸（ser）所占比例最高（13.7%），色氨酸（Trp）所占比例最低（0.8%）。同源性比对结果显示，金华猪PPARGC1A基因与山羊、牛和绵羊的同源性较高，分别为95.0%、94.9%和94.9%，在物种进化中具有较强的保守性；金华猪PPARGC1A蛋白不稳定指数为74.88，属于不稳定亲水蛋白，无跨膜结构，其二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲4种结构组成，所占比例分别为26.59%、5.73%、5.73%和61.96%，PPARGC1A蛋白同源建模经折叠、弯曲等一系列复杂的过程获得三级结构模型；实时荧光定量PCR试验和Western blotting试验结果一致，显示PPARGC1A基因在背脂较厚的金华猪中表达量显著低于瘦肉型的大白猪（P<0.05）。本研究为探明PPARGC1A基因对猪脂肪沉积的分子生物学功能提供了理论基础。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列（登录号：XM_018066209.1）,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达（P<0.05）,其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

努比亚山羊UCP1基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】试验旨在克隆努比亚山羊解偶联蛋白-1(uncoupling protein-1,UCP1)基因并进行生物信息学分析,检测其在努比亚山羊不同组织中的表达差异,为研究努比亚山羊UCP1基因功能及进一步解析其在脂肪代谢中的调节作用提供数据。【方法】以努比亚山羊皮下脂肪组织cDNA为模板,采用PCR扩增并克隆UCP1基因CDS区序列后,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建,并对UCP1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测UCP1基因在努比亚山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪、腹脂中的相对表达量。【结果】努比亚山羊UCP1基因CDS区全长918 bp,编码305个氨基酸。相似性比对发现,努比亚山羊UCP1基因氨基酸序列与绵羊、瘤牛×普通牛、水牛、羚羊、马鹿、双峰驼、驴、大熊猫、人的相似性分别为98.1%、97.0%、96.5%、96.1%、95.8%、91.0%、87.0%、86.5%和83.8%。系统进化树表明,努比亚山羊与绵羊亲缘关系最近,与人的亲缘关系最远。生物信息学分析表明,努比亚山羊UCP1蛋白的分子质量为32.97 ku,等电点为9.29,属于碱性蛋白;UCP1蛋白缺乏稳定性,总平均亲水性为0.20,具备一定亲水性;脂溶性系数为91.70,跨膜螺旋氨基酸残基数量的预测值为15.94,前60个氨基酸的跨膜螺旋数预测值为8.76,位于膜细胞质侧的总概率为29.03%,属于非分泌蛋白;UCP1蛋白二级结构由α-螺旋(48.85%)、无规则卷曲(27.54%)、延伸链(16.39%)、β-转角(7.21%)构成;UCP1蛋白含有28个磷酸化位点、5个O-糖基化位点及2个N-糖基化潜在位点。实时荧光定量PCR结果显示,UCP1基因在努比亚山羊皮下脂肪中表达量最高,显著高于其他组织(P＜0.05);在背最长肌中表达量最低。【结论】试验成功扩增UCP1基因CDS区序列,UCP1是一个缺乏稳定性、亲水的碱性蛋白;UCP1基因在努比亚山羊各组织中均有表达,且主要在皮下脂肪及脾脏中表达。结果为后续开展UCP1基因在脂肪产热供能中的机制研究提供了理论依据。     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

太行鸡CYP19A1基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆蛋鸡CYP19A1基因,对其遗传结构进行生物信息学分析并探究其在太行鸡不同组织中及不同产蛋量个体中的表达情况。以河北省太行鸡为研究对象,通过设计引物对CYP19A1基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测。结果显示,CYP19A1基因含有一个1 509 bp的开放阅读框（ORF）,编码502个氨基酸。同源性比对和系统发生树分析结果表明,太行鸡CYP19A1基因与鸭的同源性较高（90.7%）,并且在不同物种间高度保守。对CYP19A1蛋白理化性质进行预测分析发现,该蛋白为亲水蛋白,蛋白分子式为C₂₆₀₂H₄₁₀₃N₆₇₅O₇₁₉S₃₆,分子质量为57.51 ku,理论等电点为5.99,其中含量最高的是亮氨酸（为14.0%）。蛋白质二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠及无规则卷曲4种结构组成,所占比例分别为58.95%、2.18%、3.93%和34.93%。组织表达谱分析发现,CYP19A1基因在不同组织中均有表达,但其在卵巢中表达量最高。实时荧光定量PCR结果显示,CYP19A1基因在太行鸡高产组卵巢中的表达量显著高于低产组（P<0.05）。上述结果为研究太行鸡CYP19A1基因提供了重要的研究数据,为进一步挖掘太行鸡高产基因提供了参考。     

大长杂交猪DJ-1基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】克隆大长杂交猪DJ-1基因CDS区并进行生物信息学分析,探讨DJ-1基因在猪脂肪组织中的表达规律,为后续探究该基因在猪脂肪沉积中的功能奠定基础。【方法】以大长杂交猪腹股沟皮下脂肪组织cDNA为模板,PCR扩增DJ-1基因CDS区,利用在线工具对DJ-1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测DJ-1基因在大长杂交猪、大白猪（瘦肉型猪）和莱芜猪（脂肪型猪）脂肪组织中的表达量,并比较表达差异。【结果】大长杂交猪DJ-1基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸。系统进化树分析表明,大长杂交猪和牛亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。DJ-1蛋白分子质量为19.94 ku,是一种稳定的酸性、亲水性蛋白,且含有1个GAT_1超家族成员Thij结构域;无信号肽和跨膜结构域,具有21个磷酸化位点、4个N-糖基化修饰位点和1个O-糖基化修饰位点。DJ-1蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲组成,占比分别为42.86%、17.99%、7.94%和31.22%,三级结构预测结果与其一致。蛋白互作分析发现,DJ-1蛋白可能与SOD2、NDUFV2、SNCA、BCL2L1和MAP3K等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果表明,DJ-1基因在大长杂交猪背膘、腹股沟脂肪和肾周脂肪组织中均有表达,但无显著差异（P>0.05）;且在大白猪脂肪组织中的表达量显著或极显著低于莱芜猪（P<0.05;P<0.01）。【结论】本研究成功克隆了大长杂交猪DJ-1基因CDS区,其编码蛋白属稳定的酸性、亲水性蛋白,在莱芜猪脂肪组织中的表达量显著或极显著高于大白猪。本试验结果为进一步研究猪DJ-1基因功能提供理论参考。