陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

试验旨在了解陆川猪丙酮酸脱氢激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）基因CDS区序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建PDK4基因的真核表达载体,分析PDK4基因在陆川猪不同组织中的表达情况,以期为阐明PDK4基因在陆川猪生长发育过程中的分子机制奠定基础。采用RT-PCR技术扩增陆川猪皮下脂肪PDK4基因CDS区,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能,并利用常规分子克隆技术将其插入真核表达载体中获得pEGFP-N1-PDK4,用脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞并观察荧光,用实时荧光定量PCR检测PDK4基因mRNA在陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪中的表达情况。结果显示,陆川猪PDK4基因CDS区全长1 224 bp,编码407个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PDK4基因CDS区同源性达99.8%。对陆川猪PDK4基因所编码的蛋白进行生物信息学分析发现,其分子质量约为46.144 ku,原子总数为6 509个,理论等电点（pI）为7.21,带正电荷和负电荷的氨基酸数均为42个。PDK4蛋白可能有2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点。亚细胞定位结果发现,PDK4蛋白有34.8%存在于线粒体,30.4%存在于细胞质,26.1%存在于细胞核,质膜和液泡膜各占4.3%。细胞试验发现,对照组和试验组均发出荧光,相较于对照组,试验组中PDK4表达量极显著升高（P<0.01）,PDK4基因在皮下脂肪中表达丰度最高,随之为肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,在背最长肌中表达量最低,而且在皮下脂肪中的表达量极显著高于背最长肌（P<0.01）。本试验成功扩增出PDK4基因CDS区并构建了真核表达载体,成功对其结构和功能进行预测分析,为研究陆川猪皮下脂肪沉积的遗传改良提供了参考依据。     

陆川猪CSRP3基因克隆及其组织表达差异分析

【目的】克隆陆川猪的富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3(CSRP3)基因,并对其进行生物信息学和组织表达谱分析,为研究CSRP3基因在陆川猪肌肉生长过程中的作用机制打下基础。【方法】根据NCBI已公布的野猪CSRP3基因序列设计特异性定量引物和克隆引物,运用RT-PCR克隆CSRP3基因并进行生物信息学在线分析,采用实时荧光定量PCR检测CSRP3基因在陆川猪各组织中的表达差异。【结果】陆川猪CSRP3基因编码区(CDS)全长854 bp,编码194个氨基酸残基,与NCBI已公布的野猪CSRP3基因CDS序列相比存在5处同义碱基突变,且陆川猪与野猪氨基酸序列相似性达100.0%;陆川猪CSRP3基因的编码蛋白分子量为20935.82 Da,分子式为C₉₆₄H₁₄₀₄N₂₆₂O₂₇₄S₁₉,理论等电点(pI)为8.89,不稳定系数为39.11,表明其是偏碱性的稳定蛋白;CSRP3蛋白二级结构主要由无规则卷曲构成,三级结构可能有一种模型;陆川猪CSRP3蛋白除有多个磷酸化位点之外,无跨膜结构和信号肽;陆川猪CSRP3基因在心脏中表达量最高,背最长肌次之,在肝脏中的表达量最低。【结论】CSRP3基因在陆川猪心脏中表达量最高,背最长肌次之且明显高于其他组织,说明该基因可能对肌肉生长有一定影响。     

育肥猪粪便菌群结构及其与生长速度的相关性分析

【目的】 研究育肥猪的生长速度与粪便微生物之间的作用关系，寻找与猪生长速度相关的微生物菌群。【方法】 选取50头出生重相近的仔猪，在相同饲养环境中进行饲养管理，生病猪及时转出试验组，125日龄时按体重由高到低排序，把体重最高和最低的4头猪分别分为体重高（51.30 kg±2.57 kg，HW）、低（36.90 kg±2.50 kg，LW）组，通过16S rRNA测序，对125日龄生长育肥猪的粪便微生物区系多样性、群落组成及与生长速度的关联性进行分析。【结果】 Alpha多样性分析显示，两组间均无显著差异（P>0.05）。主成分分析结果显示，HW和LW组中能够明显区分菌群结构。粪便微生物结构组成分析表明，HW和LW组的优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门和螺旋体门，优势菌属为密螺旋体属、乳杆菌属、链球菌属和未被培养菌属Muribaculaceae菌。LW组中拟杆菌门丰度极显著高于HW组（P<0.01），纤维杆菌门丰度显著高于HW组（P<0.05），而髌骨细菌门丰度显著低于HW组（P<0.05）。对粪便微生物结构组成进行差异分析发现，HW组检测到16个特有菌门，LW组检测到1个特有菌门和24个特有菌属。将肠道菌群与生长速度进行相关性分析，共发现10个菌门，18个属与体重（BW）和平均日增重（ADG）呈正相关，7个菌门和12个属与BW和ADG呈负相关。【结论】 相同日龄不同生长速度的猪粪便微生物的区系结构存在显著差异，差异菌群可能对猪的生长速度起到了一定的调控作用，本研究结果为研发益生菌和提高猪生长速度提供了参考依据。