流行性乙型脑炎prM蛋白剪切位点突变的prM-E蛋白表达细胞系的建立

为建立稳定共表达乙型脑炎病-毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E.将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系.经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白.该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础.     

miR-142-3p在MCF-7细胞中靶向调节AKT pathway活性机理

为探究miR-142-3p在MCF-7细胞中作用机理,采用RNA免疫共沉淀技术和双荧光素酶报告基因技术筛选及验证miR-142-3p作用靶基因;蛋白质免疫印迹技术验证靶基因及其介导的PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白表达量及通路活性;应用实时荧光定量PCR验证靶基因PTEN对miR-142-3p调节关系。结果表明,miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达;miR-142-3p过表达组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著降低;miR-142-3p抑制组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著上升;抑制PTEN表达显著提高miR-142-3p表达量。因此miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达继而抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路活性,PTEN与miR-142-3p存在调节关系。     

Prx Ⅱ基因敲降L02细胞系的构建及其对细胞增殖的影响

构建PrxⅡ基因敲降L02细胞系并确定PrxⅡ基因对L02细胞增殖的影响。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术、流式细胞术、荧光显微照相、蛋白质免疫印迹、MTT asssay等方法建立并检验PrxⅡ敲降L02细胞系及其对L02细胞的增殖影响。结果显示:选用5’-CCGCTTGTCTGAGGATACGTT-3’片段作为干扰PrxⅡ基因片段,利用慢病毒敲降L02细胞。同时处理嘌呤霉素筛选得到shPrxⅡ组细胞和Scramble组细胞,使用流式细胞术、荧光显微照相技术对shPrxⅡ组细胞和Scramble组细胞进行检测,结果均显示出GFP蛋白表达;此后利用蛋白质免疫印迹法检测出shPrxⅡ组细胞中PrxⅡ蛋白表达水平较Blank、Scram-ble组显著降低(P0.05),Blank组与Scramble组细胞中PrxⅡ蛋白表达水平无明显差异。在MTT结果中显示shPrxⅡ组细胞增殖速率明显高于Scramble组,且具有统计学意义。成功构建PrxⅡ敲降的L02细胞系,发现PrxⅡ敲降后显著提高L02细胞的增殖速率。     

草地贪夜蛾种群性诱测报方法研究

草地贪夜蛾已经成为中国农业生产的重大害虫,准确地预测预报是指导防治的基础。本研究采用国产草地贪夜蛾性诱剂诱陷多测试了3种不同类型诱捕器对草地贪夜蛾的田间诱捕效果。结果表明,诱陷多有效期可达60 d以上,3种诱捕器中以桶型诱捕器诱捕量最高。实验室研究显示,不同日龄草地贪夜蛾雄虫精巢长轴长度有显著性差异,精巢长轴长度随日龄增加不断减小。据此规律,制定了按照精巢长轴大小判断雄蛾日龄的指标,并反演重构了田间雌、雄虫种群羽化的动态曲线。本研究表明,可以利用性诱到的雄虫的精巢发育状况推算田间种群的年龄结构,进而达到通过预测雌虫产卵与幼虫孵化动态指导防治的目的。     

转基因动物中慢病毒载体包装的优化

慢病毒载体作为基因治疗载体发展起来,现已用于转基因动物制备.本实验用磷酸钙沉淀法将转移质粒(pCCL-hCMV-eGFP)、包装质粒(pCMVΔR8.9)、包膜蛋白质粒(pMDG(VSV-G))三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,转染48 h后收集病毒上清,采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数EGFP阳性细胞法测定病毒滴度.载体滴度达2×107 TU/ml左右.     

Annexin A2基因敲除MDCK细胞系的构建

应用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除MDCK细胞中的Annexin A2基因,并验证其是否为ε毒素在MDCK细胞表面的受体。根据Crispr/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。借助Crispr/Cas9技术,将构建好的质粒转染至MDCK细胞中,用嘌呤霉素筛选敲除Annexin A2蛋白的MDCK细胞株,并通过测序和Western blot验证敲除效果。通过细胞毒性试验验证MDCK细胞膜表面的Annexin A2蛋白是否为ε毒素的受体蛋白。测序结果和Western blot结果表明,通过Crispr/Cas9技术成功敲除了MDCK细胞的Annexin A2基因,但细胞毒性试验结果表明,敲除Annexin A2基因并不能减弱ε毒素对MDCK细胞的毒性。结果表明,Annexin A2蛋白不是ε毒素在MDCK细胞表面的受体,研究结果为今后MDCK细胞其他蛋白的敲除提供了试验方法,构建的Annexin A2基因敲除的MDCK细胞也为Annexin A2蛋白引起的其他疾病的研究奠定了基础。     

稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析

建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10~6个·mL^-1,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg·L^-1;利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。     

农杆菌介导霞多丽葡萄胚性细胞系遗传转化条件的优化

为建立葡萄(Vitis vinifera)遗传转化技术体系,以霞多丽葡萄(Chardonnay)胚性细胞系为靶组织,采用GUS检测法,对影响农杆菌介导葡萄遗传转化效率的主要因素进行了研究。结果表明,超声波处理时间长短对转化效率有较大影响,在所试的0.5、1、5、10 min 4种不同时间的超声波处理中,以5 min时转化效率较好,平均达到9.11个蓝色斑点;AS浓度对转化效率有明显差异,当浓度为50μmol/L时,平均蓝色斑点数为8.89个,100μmol/L时,达到12.44个;DTT质量浓度对转化效率也有较大影响,在所试的3种质量浓度(1,2,3 mg/L)中,以3 mg/L为最佳,有16.67个蓝色斑点。通过GUS瞬时表达检测,确立了农杆菌介导葡萄胚性细胞系遗传转化的几个最适影响因素,从而为葡萄遗传转化技术体系的建立奠定了基础。     

甘蓝夜蛾核型多角体病毒连续传代的研究

对甘蓝夜蛾核型多角体病毒（ ＭｂＮＰＶ） 在同源寄主细胞系ＮＥＡＵＭｂ９３１１０４（ Ｍｂ９３１１０４） 中的生长特性进行了研究。结果表明,无包涵体游离病毒（ ＭｂＮＰＶ＿ＮＯＶ） 在接种后１４ ｈ 达到吸收高峰,病毒滴度降到最低值５－７９ ×１０２ＴＣＩＤ５０／ｍ Ｌ,接种病毒９６ ｈ,病毒滴度达到最高值２－１３ ×１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ,在ＮＯＶ（ｎｏｎｏｃｃｌｕｄｅｄ ｖｉｒｕｓ） 连续传递２０ 代的过程中,ＭｂＮＰＶ＿ＮＯＶ 毒力随传递代数的增加而减低,并且多角体的毒力也发生了显著的变化,前几代能使甘蓝夜蛾幼虫死亡率在９０ ％ 以上,传递到１５ 代以后产生的多角体对甘蓝夜蛾的幼虫几乎没有毒力。     

动物细胞系的染色体组型分析和致癌／致瘤性

为确定供生物制品和生物工程产品生产所用动物传代细胞系有无致癌／致瘤性,对研制生产犬、貉、狐用五联病毒,即犬狂犬病病毒（ＲＶ）、犬瘟热病毒（ＣＤＶ）、犬细小病毒（ＣＤＶ）、犬腺病毒２型（ＣＡＶ２）和犬副流感病毒（ＣＰＩＶ）的活疫苗以及猫、狮、虎、豹用三联病毒,即泛白细胞减少症病毒（ＦＰＬＶ）、猫疱疹病毒１型（ＦＨＶ１）和猫杯状病毒（ＦＣＶ）的活疫苗,所用猫肾细胞系（Ｆ８１,ＣＲＦＫ）、犬肾细胞系（ＭＤＣＫ）、非洲绿猴肾细胞系（Ｖｅｒｏ,Ｖｅｒｏ２）、恒河猴肾细胞系（ＭＡ１０４）和叙利亚金…