靶向猪内质网应激通路的microRNAs预测与验证

【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs(miRNAs),为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾上皮(PK15)细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾(BHK-21)细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT-PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR-142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA-miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。     

绵羊甲状腺miR-370-3p靶向COL4A3基因调控繁殖力性状的初步研究

为探讨小尾寒羊甲状腺组织中与繁殖功能相关的miR-370-3p与COL4A3的靶向关系,本研究利用miRDB与Targetscan网站预测了miR-370-3p的靶基因,并取其交集进行功能富集分析,通过RNAhybrid与Targetscan网站预测绵羊miR-370-3p与候选靶基因的结合位点;随后检测了miR-370-3p与COL4A3基因在小尾寒羊甲状腺组织中的相对表达量。构建psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型/突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics/mimics NC共转染至HEK293T细胞并检测荧光活性。结果显示：1)miR-370-3p的靶基因可富集到孕酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路和FoxO信号通路等与动物繁殖有关的信号通路中。2)miR-370-3p可与COL4A3基因3′UTR区域结合,且两者在小尾寒羊甲状腺组织中表达呈相反趋势。3)共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型和miR-370-3p mimics组的荧光素酶活性显...     

靶向猪内质网应激通路的microRNAs预测与验证

【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs（miRNAs）,为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒（PRV）感染猪肾上皮（PK15）细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾（BHK-21）细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1- m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK- 2-XBP1-m142/ 145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/ 150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/ 150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT- PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR- 142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA- miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。     

靶向PIK3CA和AKT3基因RNA干扰对家兔SCs增殖的影响

PI3K与AKT组成的PI3K-AKT信号通路在细胞的增殖以及凋亡具有重要意义,本试验旨在研究该信号通路在家兔SCs增殖过程中发挥的作用。采用siRNA介导的PIK3CA和AKT3基因进行基因的沉默表达。结果发现对处于对数生长期的细胞转染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后48 h,分别对靶基因和上下游基因PTEN和Fox O1进行qRT-PCR反应,并采用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测其在转染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后对细胞增殖能力的影响。结果表明:在转染si-PIK3CA-03后,PIK3CA和AKT3基因的相对表达量均显著下调,PTEN和Fox O1基因的表达量均显著上调;当转染了si-AKT3-01后,PTEN和FoxO1基因表达量均显著上调。表明PTEN、Fox O1基因与PIK3CA、AKT3基因的相对表达量呈负相关。转染实验组OD值显著低于空白对照组(P0.05),说明通过转染实验下调PIK3CA和AKT3基因表达后,细胞增殖能力均有显著的下降。由此说明,分别抑制表达PIK3CA、AKT3基因后,靶基因的表达量显著下降,家兔SCs的增殖能力也显著下降,说明PIK3CA、AKT3基因能够正向调控肌细胞的增殖。     

miR-222-3p在鹅肥肝形成中的作用及靶基因验证

为了检测miR-222-3p在填饲鹅不同组织中的表达情况，并对其靶基因进行预测和验证，探讨miR-222-3p在鹅肥肝形成中的功能。运用实时荧光定量 PCR技术检测miR-222-3p 在填饲鹅肝脏、胸肌和腹脂中的表达量；采用生物信息学方法对鹅miR-222-3p的靶基因进行预测，荧光定量PCR技术检测预测靶基因在肝脏中的表达量，并利用双荧光素酶基因报告系统验证其靶向关系。结果显示：相比对照组，miR-222-3p 在填饲鹅肝脏和腹脂中的表达量均显著升高；生物信息学预测结果显示MARF1和B4GALNT3基因在3’UTR区域存在miR-222-3p的潜在结合位点，且这两个基因在鹅肥肝中均显著下调，而双荧光素酶基因报告系统显示只有MARF1基因与鹅 miR-222-3p存在靶向关系。结果表明，miR-222-3p在鹅肥肝中表达量显著上调，且可能通过其靶基因MARF1对鹅肥肝的形成发挥调控作用。     

miR-127-3p对C2C12细胞成肌分化和转录组的影响

前期研究表明,miR-127-3p参与骨骼肌细胞分化的调控,但对于miR-127-3p调控的靶基因及其在成肌分化中的作用还不清楚。应用qRT-PCR与细胞形态学方法研究过表达miR-127-3p对C2C12成肌细胞分化及成肌标志基因MyoD、MyoG和Myosin表达的影响;RNA-Seq分析过表达miR-127-3p对成肌细胞转录组的影响,鉴定差异表达基因并对其功能进行初步研究。结果表明,过表达miR-127-3p显著促进C2C12细胞的成肌分化与MyoD、MyoG和Myosin表达;RNA-Seq分析共鉴定到3个差异基因,均为下调基因,其中包括2个转录因子(Irf7和Ddit3)。GO与KEGG分析显示,这些差异基因显著富集于免疫和能量代谢过程/信号通路。生物信息学分析发现,miR-127-3p可与Ddit3基因的CDS区发生碱基互补配对,进而抑制其表达。表明在转录组水平上,miR-127-3p可能通过直接靶向Ddit3基因/转录因子调控免疫与能量代谢类基因的表达,进而调节成肌细胞分化。     

猪miR-149靶基因预测及生物信息学分析

通过对猪miR-149进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索其影响猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的作用机制。首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ssc-miR-149在氧化应激组和正常组表达量的变化,通过转染miR-149 mimic并利用MTT和qRT-PCR检测细胞活性和凋亡基因的表达情况,同时预测ssc-miR-149与细胞凋亡相关基因的靶向关系;然后利用JASPAR、PROMO、TargetScan、miRanda、RNAhybrid、DAVID等软件和NCBI、miRBase、Ensembl等数据库对ssc-miR-149进行转录因子结合位点预测、保守性分析、靶基因预测、GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。结果表明,氧化应激组ssc-miR-149的表达量极显著下调;但过表达ssc-miR-149时,能极显著提高细胞活性,并抑制H_2O_2诱导的凋亡相关基因(Caspase-3、PUMA和FAS)的表达;ssc-miR-149启动子区域具有SP1、p53等多个转录因子结合位点,其靶基因显著富集于TNF信号通路、Rap1信号通路和NOD样受体信号通路等。由此推测,ssc-miR-149受到SP1等多种转录因子调控,它可能通过抑制TNF、Rap1和NOD信号通路中的靶基因PUMA、Caspase-9和FAF-1来调控猪颗粒细胞的凋亡,进而影响猪的卵泡发育。     

miR-31-5p对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。     

miR-221-3p靶向BCL2L11调控小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和 BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）,阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低（P<0.05）;EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%（P<0.01）。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。     

小鼠miR-151-3p靶基因筛选和鉴定

采用生物信息软件系统分析miR-151-3p的保守性,并筛选出与小鼠肌肉发育和肿瘤发生相关靶基因:蛋白激酶3(serine/threonine kinase 3,Akt 3),Twist碱性螺旋-环-螺旋转录因子(twist basic helix-loophelix 1,Twist 1)和T型电压依赖性钙通道α1g亚基(calcium channel,voltage-dependent,T type,alpha 1g subunit,Cacna1g)。采用实时定量PCR及双荧光素酶报告基因检测技术对以上靶基因进行初步验证,结果表明,超表达miR-151-3p显著抑制Akt 3mRNA表达,而Twist 1和Cacna1g mRNA表达变化不显著;双荧光素酶报告系统分析发现,miR-151-3p显著抑制野生型Akt 3报告载体相对荧光素酶活性,突变Akt 3 3′UTR与miR-151-3p结合的位点后,相对荧光素酶活性得到恢复,而Twist 1和Cacna1g基因双荧光素酶报告载体无此现象,结果证实Akt 3是miR-151-3p的靶基因。     

miR-486对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖及PI3k-Akt信号通路相关基因表达的影响

【目的】明确miR-486对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖及PI3K-Akt信号通路相关基因表达的影响,为揭示miR-486对绵羊骨骼肌发育的调控机制打下基础。【方法】以巴什拜羊1日龄羔羊后肢骨骼肌卫星细胞为研究对象,通过转染miR-486 mimics和miR-486 inhibitor致使绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调或下调,探究miR-486对骨骼肌卫星细胞增殖速度及PI3K-Akt信号通路中PTEN、GSK3b、PRKCα、Raf-1、MAPK1、PKN1、Casp9和SGK1等8个相关基因表达变化的影响。【结果】空白对照及转染miR-486 mimics、miR-486 mimics negative control和miR-486 inhibitor negative control的绵羊骨骼肌卫星细胞均表现出典型的S形增殖曲线,但各处理间的细胞增殖速度存在明显差异。当绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调可促使细胞进入快速增殖状态,而miR-486水平下调可使细胞保持静止状态。实时荧光定量PCR检测结果表明,当绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调时,可引起PTEN、Raf-1和MAPK1基因相对表达量极显著下调（P<0.01,下同）,PRKCα和PKN1基因相对表达量极显著上调,SGK1基因相对表达量显著上调（P<0.05）;而GSK3β和Casp9基因相对表达量在不同处理组绵羊骨骼肌卫星细胞间的差异均不显著（P>0.05）,可能在维持绵羊骨骼肌卫星细胞基本生命活动中发挥作用。【结论】miR-486通过调控PI3K-Akt信号通路相关基因的表达而参与绵羊骨骼肌卫星细胞生长发育及增殖,为深入研究miR-486对绵羊骨骼肌发育的调控机理及优质肉羊品种培育打下了理论基础。     

MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB 3′-UTR的双荧光素酶报告载体。从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性。便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养。用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平。为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红O染色。【结果】miR-433-3p在BCKDHB3′-UTR的第8—28个碱基处存在理论上的结合位点。通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3′-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3′-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性。在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的m RNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB m RNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红O染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红O染色验证了脂滴的聚集。另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量呈现负相关关系。【结论】这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3′-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。     

卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关性

细胞自噬是哺乳动物细胞物质代谢的一个重要机制,与细胞凋亡共同参与卵巢卵泡的发育和闭锁,并发挥重要的作用。近年研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路参与卵巢疾病的发生。PI3K和AKT的过度激活可使原始卵泡过早发育以及卵泡过快凋亡,卵巢颗粒细胞作为卵泡发育重要的支持细胞,其功能的减退或凋亡很可能引发一系列女性内分泌方面的疾病。FOXO3a转录因子是PI3K/AKT信号通路下游的重要靶蛋白之一,参与抗增殖和凋亡。本文就关于卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关进展加以综述。     

羟基喜树碱(HCPT)对乳腺癌细胞中TIMP-3表达及细胞侵袭能力的影响

目的:探索羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7细胞信号转导相关基因金属蛋白酶组织抑制剂-3(TIMP-3)表达的影响,寻找羟基喜树碱(HCPT)在乳腺癌治疗中的潜在新靶点.方法:分别采用Q-PCR,Western-blot和免疫细胞化学等方法验证不同剂量组HCPT诱导MCF-7细胞的TIMP-3表达特征.结果:不同质量浓度的HCPT均可在mRNA水平和蛋白水平诱导MCF-7细胞的TIMP-3表达上调,且具有统计学意义,与前期的基因芯片研究结果相符合;实验同时观察了HCPT对细胞侵袭迁移能力的影响,结果亦显示HCPT可在TIMP-3表达上调的同时抑制细胞侵袭迁移能力.结论:HCPT可诱导乳腺癌细胞的TIMP-3上调表达,抑制细胞侵袭能力.     

miR-423-5p在牛肌肉组织中表达及其靶基因预测

miR-423-5p在细胞中具有重要的生物学功能,如在肌细胞中能影响细胞的增殖。根据miRBase及NCBI网站显示的相关信息利用分析软件对miR-423在各物种之间的同源性进行了分析。取成年西门塔尔牛体内的骨骼肌、小肠、心脏组织利用茎环荧光定量PCR进行miR-423-5p表达量检测,将牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)分化处理不同时长后进行检测;最后通过在线软件(TargetScan、PicTar)预测其可能结合的靶基因。结果表明,miR-423-5p在各物种间具有较高的同源性,在骨骼肌中表达量明显高于其他组织。在MDSCs中,随着细胞分化时间的延长,miR-423-5p表达量逐渐升高。miR-423-5p在12个基因mRNA的3'-UTR上含有潜在的结合位点,其中部分靶基因参与细胞的增殖、分化和凋亡。结果提示,miR-423-5p可能参与细胞的生长代谢,调节细胞的增殖与分化。     

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。     

斑马鱼miR-30e对血细胞生成的作用机制研究

microRNA(简写为miRNA)是一类内源基因编码的单链RNA分子,参与转录后基因的表达调控,在血液生成过程中起着重要作用。为研究miR-30e对鱼类血液生成的作用机制,以斑马鱼Danio rerio作为模式生物,针对青藏高原裂腹鱼血液组织中高表达的miR-30e,利用生物信息软件预测斑马鱼miR-30e的靶基因,构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的双荧光素酶报告质粒与斑马鱼miR-30e进行共转染,检测细胞双荧光素酶活性的变化;同时构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的绿色荧光蛋白质粒,与miR-30e共同显微注射斑马鱼胚胎,观察GFP荧光强度与蛋白表达量的变化。结果表明:斑马鱼胚胎在注射miR-30e模拟体48 h后,其血红蛋白表达明显减少;转染miR-30e的293T细胞双荧光素酶活性显著降低(P<0.05);斑马鱼胚胎注射miR-30e模拟体24 h后,其GFP荧光强度明显降低,且GFP蛋白表达量明显减少。研究表明,ALAS2基因是miR-30e的一个靶基因,miR-30e通过抑制ALAS2表达而抑制血红细胞的生成。