南极独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)miR-204对斑马鱼胚胎血管发育的作用机制研究

南极独角雪冰鱼（Chionodraco hamatus）是目前已知的唯一缺乏血红蛋白、且不具有功能性血红细胞的脊椎动物。与相同生境下的其他南极鱼相比，其血管明显变粗，毛细血管增多。前期对南极独角雪冰鱼与近缘种伯氏肩孔南极鱼（Trematomus bernacchii）的血管microRNAs表达进行对比，发现南极独角雪冰鱼的miR-204的表达与伯氏肩孔南极鱼间存在显著差异，推测miR-204极有可能参与了南极冰鱼血管发育的调控。为证明此假设，运用斑马鱼（Barchydanio rerio）这一模式生物，利用斑马鱼胚胎显微注射技术、靶基因预测、双荧光素酶报告系统等一系列分子生物学手段对miR-204在斑马鱼血管发育中的调控作用进行探究。结果显示，抑制miR-204表达能使斑马鱼胚胎躯干部毛细血管增生。荧光素酶活性分析表明，miR-204可以显著降低trib3的表达，同时在斑马鱼胚胎中共注射miR-204和trib3后的GFP萤光强度显著降低，GFP蛋白量减少，说明miR-204对trib3有抑制作用。trib3最初发现是抑制果蝇胚胎和生殖细胞有丝分裂的假激酶，后续研究发现其参与动脉粥样硬化的调控以及糖尿病血管纤维化。综上，推测miR-204可能通过抑制trib3的表达进而调控毛细血管的增生。     

靶向猪CLTC基因miRNA的预测与验证

网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞的重要途径,网格蛋白重链(clathrin heavy chain,CLTC)是形成网格蛋白小窝结构的重要组成部分。针对CLTC基因的转录后调控特别是调控猪Sus scrofa CLTC的miRNA目前还不太清楚。本研究旨在筛选出调控猪CLTC基因的miRNA。利用生物信息学方法预测出6个靶向猪CLTC基因的miRNA,将猪CLTC基因3′UTR克隆至双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中获得双荧光素酶报告基因重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR。将预测得到的miRNA分别和重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR共转染到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对重组质粒荧光素酶活性的影响。结果发现miR-205,miR-1,miR-129-5p和miR-206均能够显著抑制荧光素酶活性(P0.05)。在猪肾上皮细胞系PK15细胞中超表达miR-1和miR-129-5p后,定量PCR(q-PCR)结果显示:猪CLTC基因的表达量显著下调。突变了psi CHECK2-CLTC-3′UTR载体中这4个miRNA的种子序列的结合位点发现:miR-1对突变质粒中的荧光素酶无显著抑制作用。表明miR-1与猪CLTC基因有直接的靶向关系,并通过其种子序列抑制CLTC基因的表达。     

PDPK13′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证

本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。     

草鱼SREBP-1-3''-UTR双荧光素酶报告载体构建及miR-33对其表达的影响

为研究草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-33在固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element binding protein 1,SREBP-1)调节脂代谢中的作用,构建了草鱼SREBP-1基因3'端非翻译区(Untranslated region,UTR)含miR-33靶序列的双荧光素酶报告基因载体。首先用PCR法获得SREBP-1 mRNA含miR-33结合位点的3'UTR序列(379 bp),与双荧光素酶报告载体pmir GLO重组后转染DH5α感受态细胞。然后经筛选和双酶切鉴定,获得含有SREBP-1基因3'-UTR的双荧光素酶报告载体:pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR。最后在草鱼肝细胞L8824共转染miR-33mimics和pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR,明确miR-33与SREBP-1基因3'UTR区的靶向关系。结果表明,含有SREBP-1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告基因载体构建成功,PCR、双酶切和基因测序证明序列与目标一致;转染pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR的L8824细胞可表达荧光素酶,单独转染载体组的荧光素酶活性显著高于共转染载体和miR-33 mimics组(P0.05)。本研究证实草鱼SREBP-1是miR-33的直接靶基因,miR-33通过和SREBP-1 mRNA 3'UTR结合,调控SREBP-1基因的转录后表达。     

miR-210-5p对南极独角雪冰鱼心脏发育的作用机制研究

microRNA为短链非编码RNA,通过与靶基因3'UTR序列互补在转录后水平发挥作用。已有研究表明,microRNA在心脏发育过程中起着重要的调控作用。南极冰鱼因体内缺乏功能性血红细胞,其心脏出现了补偿性增生。前期的研究提示,独角雪冰鱼心脏中特异表达的microRNAs可能与冰鱼心脏的补偿性增生相关。本研究针对南极冰鱼心脏中高表达的miR-210-5p,运用斑马鱼显微注射、靶基因预测等手段研究了miR-210-5p对心脏发育的作用机制。结果表明:斑马鱼胚胎注射miR-210-5p后,出现心包膜水肿,心脏发育畸形等现象。qRT-PCR分析显示,过表达miR-210-5p的斑马鱼胚胎中,心脏发育相关的标志性基因bmp4、smad1、gata6以及tbx2b的表达水平下调。Western blotting分析发现,bmp/smad通路中的BMP2、BMP4、SMAD1、GATA6以及TBX2B的蛋白表达水平也显著下调。通过对tbx20基因3'UTR的靶基因生物信息学预测,以及对其进行GFP荧光表达分析,发现tbx20基因可能是miR-210-5p的一个靶基因。由此推测,miR-210-5p可能通过抑制tbx20基因的表达,并调控bmp/smad通路以抑制冰鱼心脏发育。     

靶向猪内质网应激通路的microRNAs预测与验证

【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs(miRNAs),为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒(PRV)感染猪肾上皮(PK15)细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾(BHK-21)细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT-PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR-142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA-miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。     

miR-27a与SCF靶向关系鉴定

为确定miR-27a与SCF的靶向关系,剪取成年棕色小鼠和灰色小鼠的皮肤组织,q RT-PCR检测miR-27a和SCF的表达量,选用Pic Tar、Target Scan和DIANA-micro T 3个数据库对miR-27a进行靶基因预测,构建miR-27a的真核表达载体和SCF 3'UTR(含种子序列)的双荧光表达载体,并对种子序列进行突变处理,以miR-27a过表达载体或NC载体(空载)组合SCF 3'UTR双荧光报告载体或SCF 3'UTR的突变载体共转染HEK 293 T细胞,48 h后检测双荧光素酶活性。q RT-PCR结果显示,miR-27a在灰色小鼠皮肤中的表达量极显著高于棕色小鼠(P0.01),而SCF在棕色小鼠皮肤中的表达量显著高于灰色小鼠(P0.05);3个数据库的分析结果均显示,SCF是miR-27a的靶基因;双荧光报告试验结果显示,miR-27a能显著抑制双荧光活性,即miR-27a能与SCF 3'UTR的种子序列结合。综上所述,SCF是miR-27a的靶基因。     

miR-145靶向FSCN1的鉴定研究

miRNA 是参与机体许多生理功能调控的重要因素之一。本研究以miR-145 为研究对象,旨在通过三个靶基因预测软件(miRanda、PicTar 及TargetScan)进行miR-145 的靶基因的预测,以此来得到miR-145 可能靶向FSCN1 基因的结论。通过实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹检测和双荧光素酶报告试验多重验证筛选miR-145 靶基因。研究发现:在细胞水平中,miR-145 的过表达会导致FSCN1 的mRNA 显著下调,当miR-145 被抑制表达的时候,会导致FSCN1 的mRNA 水平显著上调。此外,荧光素酶报告试验显示,FSCN1 基因的3′UTR 存在着miR-145 的靶向结合位点,其在miR-145 的作用下可显著下调FSCN1 活性。研究结果将明晰miR-145 通过FSCN1 来发挥生物学功能,为探索人类及动物调控机理提供了可靠的参考价值。     

靶向猪内质网应激通路的microRNAs预测与验证

【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs（miRNAs）,为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒（PRV）感染猪肾上皮（PK15）细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾（BHK-21）细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1- m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK- 2-XBP1-m142/ 145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/ 150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/ 150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT- PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR- 142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA- miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。     

小鼠胚胎着床相关基因中mir-21靶基因的初步验证

利用microRNA靶位点预测网站结合小鼠胚胎着床芯片数据预测了mir-21的5个与着床相关的靶基因:Reck、F3、Upk1 b、Ggh、Tmed6,通过分别构建含有靶基因3′UTR的重组报告载体、pre-mir-21或/和mir-21inhibitor体外转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定mir-21的靶位点。pre-mir-21可显著降低转染上述5个重组载体的细胞内荧光素酶活性;mir-21 inhibitor可显著增加转染Reck、Upk1 b和Tmed63′UTR的重组载体的细胞内荧光素酶活性;pre-mir-21和mir-21 inhibitor共转染可分别显著增加转染含有Reck3′UTR、F33′UTR、Upk1 b3′UTR和Ggh3′UTR的重组载体的细胞内荧光素酶活性。Reck和Upk1b可能是mir-21的靶基因。     

3＇ Noncoding Region Construction of GHR Gene-luciferase Report Vector and Valuation

To analyze miR-139 target sites in 3＇ UTR of GHR gene in dairy cow mammary gland, a GHR 3＇ UTR- luciferase reporter vector was constructed and the effect of miRNA on its activity was evaluated in dairy...     

核定位信号肽和转运肽对斑马鱼转基因效率的影响

为了探讨核定位信号肽S413-PV和转运肽Tp10这2种融合肽对转基因效率的影响,将S413-PV和Tp10与线性化质粒分别以质量比50∶1、100∶1、200∶1混合制成转染液,注射斑马鱼单细胞期胚胎,分别检测转染24 h、120 h后胚胎的阳性率和成活率。结果表明:与对照组相比,转染24 h后,S413-PV组胚胎阳性率极显著上升,胚胎成活率均下降,但差异不显著;Tp10组阳性率均呈上升趋势,200∶1组差异极显著,其他组差异不显著,胚胎成活率均显著下降;转染120 h后,S413-PV组胚胎阳性率均极显著上升,胚胎成活率均呈下降趋势,100∶1、200∶1组差异极显著;Tp10组胚胎阳性率上升,200∶1组差异显著,胚胎成活率均极显著下降。以上结果表明,S413-PV可显著提高斑马鱼转基因效率,对胚胎毒性较小;Tp10对转基因效率影响不显著,且对胚胎毒性较强。     

MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB 3′-UTR的双荧光素酶报告载体。从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性。便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养。用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平。为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红O染色。【结果】miR-433-3p在BCKDHB3′-UTR的第8—28个碱基处存在理论上的结合位点。通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3′-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3′-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性。在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的m RNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB m RNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红O染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红O染色验证了脂滴的聚集。另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量呈现负相关关系。【结论】这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3′-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。     

miR-663通过靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验证mi R-663的直接靶基因是TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染mi R-663 mimic来过表达mi R-663,并利用q RT-PCR和Western blotting检测mi R-663过表达后细胞中TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin分别在m RNA和蛋白水平的变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示mi R-663有68个保守的靶基因,包含74个保守的靶位点和44个非保守靶位点。TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的TGF-β1基因的3′UTR区相似性较高且均存在多个保守的mi R-663靶位点。克隆了羊驼TGF-β1基因3′UTR区发现存在3个保守的mi R-663靶位点。成功构建包含3个mi R-663作用位点的pmir GLO-TGF-β1-3′UTR双荧光报告载体并与mi R-663 mimic共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与对照组相比,试验组pmir GLO-TGF-β1-3′UTR+mi R-663 mimic荧光素酶活性下调31.01%,表明TGF-β1是mi R-663直接的靶基因。在羊驼黑色素细胞中转染mi R-663 mimic后:mi R-663表达量上调334倍,TGF-β1、β-catenin、Smad4基因的表达量分别下调89%、41%、34%;TGF-β1蛋白表达量下降了21%,β-catenin蛋白表达量无明显差异;黑色素细胞中的黑色素含量下降42%。【结论】TGF-β1是mi R-663的直接靶基因。mi R-663通过调控TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad和Wnt信号通路,进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素生成。     

海七鳃鳗pma-miR-200c-3p对斑马鱼心脏发育的作用研究

为研究海七鳃鳗Petromyzon marinus pma-miR-200c-3p在心脏发育过程中的生物学功能,采用显微注射技术,将pma-miR-200c-3p模拟体注射到斑马鱼Danio rerio胚胎,过表达pma-miR-200c-3p后,使用qRT-PCR及Western blot法检测了一些与心脏发育相关的标志性基因的表达水平,以及BMP/Smad通路重要基因蛋白水平的变化,并利用生物信息学预测、GFP荧光表达分析了pma-miR-200c-3p的生物学作用。结果表明:过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼胚胎中,与心脏发育相关的标志性bmp4、bmp5、smad1、gata5、tbx2b和notch1a基因的表达水平极显著上调(P0.01),同时BMP/Smad通路中BMP4、Smad1、GATA5蛋白表达水平也明显升高;细胞试验表明,cdx1b基因可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因。研究表明,pma-miR-200c-3p可能通过抑制cdx1b基因的表达,参与BMP/Smad通路以促进心脏发育。     

MicroRNA-370-5p inhibits pigmentation and cell proliferation by downregulating mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 expression in sheep melanocytes

In mammals, microRNAs (miRNAs) play key roles in multiple biological processes by regulating the expression of target genes.  Studies have found that the levels of miR-370-5p expression differ significantly in the skins of sheep with different hair colors; however, its function remains unclear.  In this study, we investigated the roles of miR-370-5p in sheep melanocytes and found that the overexpression of miR-370-5p significantly inhibited cell proliferation (P<0.01), tyrosinase activity (P=0.001) and significantly reduced (P<0.001) melanin production.  Functional prediction revealed that the 3´-untranslated region (UTR) of MAP3K8 has a putative miR-370-5p binding site, and the interaction between these two molecules was confirmed using luciferase reporter assays.  In situ hybridization assays revealed that MAP3K8 is expressed in the cytoplasm of melanocytes.  The results of quantitative RT-PCR and Western blotting analyses revealed that overexpression of miR-370-5p in melanocytes significantly inhibits (P<0.01) MAP3K8 expression via direct targeting of its 3´ UTR.  Inhibition of MAP3K8 expression by siRNA-MAP3K8 transfection induced a significant inhibition (P<0.01) of melanocyte proliferation and significant reduction (P<0.001) in melanin production, which is consistent with our observations for miR-370-5p.  Target gene rescue experiments indicated that the expression of MAP3K8 in melanocytes co-transfected with miR-370-5p and MAP3K8-cDNA (containing sites for the targeted binding to miR-370-5p) was significantly rescued (P≤0.001), which subsequently promoted significant increases in cell proliferation (P<0.001) and melanin production (P<0.01).  Collectively, these findings indicate that miR-370-5p plays a functional role in inhibiting sheep melanocyte proliferation and melanogenesis by downregulating the expression of MAP3K8.