猫瘟热病毒胶体金快速检测试纸的研究

利用双抗体夹心和胶体金免疫层析技术的原理,在玻璃纤维膜、硝酸纤维膜的检测线(T)和对照线(C)上分别喷上胶体金与猫瘟热病毒(FPV)单克隆抗体(3C4)的偶联物、FPV多克隆抗体和羊抗鼠IgG单克隆抗体,制成检测FPV抗原的猫瘟热病毒胶体金快速检测试纸,对临床26份虎粪便样本进行检测,并与PCR检测法及韩国(ASAN ...     

猪伪狂犬病病毒检测方法研究进展

随着免疫学与分子生物学技术日臻完善,针对猪伪狂犬病的血清学方法和分子生物学检测方法不断改进.论文就近年来针对猪伪狂犬病病毒的中和试验、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、胶体金免疫层析、核酸探针、基因芯片、多重PCR、LAMP等检测方法研究概况做一综述,为寻找合适的快速准确的检测方法、制定合理的免疫程序和发展新型的检测方法...     

稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础.     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体制备及鉴定

为制备鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的SVCV免疫BALB/c鼠,通过杂交瘤细胞技术,制备2株抗SVCV的MAb,分别命名为2A3和3H7。经间接ELISA检测腹水效价为1:10240和1:12150。亚类鉴定证实,这2株亚类均为IgG1型。经非竞争酶免疫试验测定2A3和3H7的抗体亲和力常数分别为4.86×108L/mol和1.86×109L/mol,3H7相对亲和力高于2A3。MAb 2A3和3H7的饱和度均为1:400,叠加试验所得增值指数为63.2%,大于50%。抗体反应增值结果表明:两株MAb分别针对不同抗原位点。免疫印迹分析检测表明,两株纯化的MAb均可与SVCV抗原发生特异反应。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。     

三黄鸡临床多发性肿瘤相关的J亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其病理学观察

为研究蛋鸡多发性肿瘤的病因,本实验对病鸡肿瘤组织进行病毒分离、培养及PCR检测,均扩增出针对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85基因序列的阳性条带;组织病理学观察显示发病鸡呈现髓细胞瘤、血管瘤以及纤维肉瘤等多发性肿瘤的病理变化;肿瘤细胞通过血液转移、浸润,在肝和脾组织形成局灶性或弥漫性肿瘤病灶。免疫组化染色显示肿瘤组织内,部分肿瘤细胞呈现阳性反应,表明只有部分肿瘤细胞存在ALV-J感染,而大部分肿瘤细胞检测结果呈阴性。这些病毒检测为阴性的肿瘤细胞可能是正常细胞转化为肿瘤细胞大量克隆化增殖的结果。     

禽传染性喉气管炎病毒体内外感染模型中鸡Toll样受体21mRNA转录水平的研究

为研究病毒与机体的相互作用,本研究参考GenBank中鸡Toll样受体21 (ChTLR21)的基因序列设计实时定量PCR特异性引物,以鸡核糖体蛋白L4 (RPL4)为内参基因,建立检测ChTLR21 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析ChTLR21在禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中和感染SPF雏鸡免疫器官脾脏、法氏囊和胸腺组织中的转录水平.结果显示:ILTV感染CEF后2h、4h、8h和18h时间点ChTLR21 mRNA转录水平分别为未感染对照细胞的1 540.53、0.98、1.19和3.70倍.但仅在ILTV感染2h时引起ChTLR21转录水平升高,与对照组相比差异显著(P＜0.05).ILTV感染SPF雏鸡后6h、24 h和30 h脾脏中ChTLR21 mRNA转录水平分别为未感染对照的56.34、59.85和3.61倍;法氏囊中分别为0.03、25.98和3.08倍;胸腺中分别为2.52、50和7.32倍.在感染初期,脾脏中ChTLR21转录量显著升高,随后有所降低,但均高于未感染对照(p＜0.05);法氏囊中仅在感染6h时呈显著抑制(p＜0.01);胸腺中呈波动性转录水平升高,但与对照组无统计学差异(p＞0.05).本研究证明ChTLR21参与了鸡体对ILTV感染的应答,并在体内外感染模型中呈现不同的表达规律.     

马立克氏病病毒感染鸡羽髓上皮细胞差异蛋白质组学研究

为鉴定鸡羽髓上皮细胞感染马立克氏病病毒(MDV)前后差异表达的蛋白,本研究以MDV强毒GA株人工感染SPF鸡,并通过双向电泳技术进行分析.结果显示:在病毒感染后4 d、7 d、14 d和21 d显著差异表达的蛋白点分别有2个、8个、25个和9个;而通过质谱技术鉴定出29种蛋白质,其中包括能量代谢相关蛋白、增殖和凋亡相关蛋白、细胞骨架蛋白、信号传导蛋白、转录相关蛋白、免疫相关蛋白和其他功能蛋白质.本实验首次对鸡羽髓上皮细胞感染MDV后各时期蛋白表达水平的变化进行研究,鉴定了多种差异表达蛋白质,为进一步揭示MDV与宿主的相互关系、感染性病毒粒子的成熟和致病机制提供了依据.     

抗猪输血传播病毒1型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗猪输血传播病毒1型(TTV1) Cap蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用PCR法扩增TTV1ORF1 (1501nt～2475nt)编码重组Cap蛋白的C末端截短序列,将PCR产物克隆于pGEX-6P-1载体中,并在大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株中诱导表达,获得含GST标签的重组蛋白(rCap),经SDS-PAGE和western blot鉴定表明rCap约为64.0.ku,以包涵体形式存在.用纯化的rCap免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗rCap蛋白的杂交瘤细胞株,MAb亚类均为IgGl/κ型;western blot鉴定表明有7株MAbs与rCap产生特异性反应,另1株MAb呈阴性.为验证8株MAbs与真核表达的Cap蛋白的免疫反应性,将全长与截短的TTV1ORF1基因片段克隆于pcDNA3.1载体,转染293T细胞进行蛋白瞬时表达,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法检测表明,这8株MAbs均能够与瞬时表达的全长rCap产生特异性反应,其中6株与截短表达的rCap反应.本研究表达的rCap蛋白及制备的MAbs,为该病毒检测方法的建立及抗原表位的鉴定奠定了基础.