根癌农杆菌介导的稻瘟病菌近等菌系的构建与初步应用*

 利用根癌农杆菌C58C1介导转化1株致病力极弱的野生型稻瘟病菌菌株CY2,成功地获得3000多个转化子,混合接种于携带25个不同抗病单基因的水稻近等基因系上,获得4株单胞致病突变体;继代培养和PCR检测表明,这些突变体均为T-DNA插入CY2的后代,而非自发突变或外源菌株污染。将4株突变体与实验室已保存的20株致病突变体分别回接水稻近等基因系,推断其携带的致病基因类型,结果表明突变体分别针对13个抗性单基因的18个单基因系发生了突变,其中针对Pi-a,Pik-s,Pi-sh单基因系表现出较高的侵染频率。由于这些突变体均来自同一个菌株,仅致病性存在差异,属于近等菌系,利用其分析出102个水稻品种中的34个品种的抗病基因组成,其中,抗病基因Pik-s,Pi-a,Pi-sh,Pi-19(t)分布频率较高,分别达70.59%,61.76%,52.94%和44.12%,且带有这类基因的糯稻品种多于杂交水稻。     

黄瓜褐斑病防治药剂的离体活性筛选

离体条件下针对黄瓜褐斑病菌对19种杀菌剂进行了活性筛选。结果表明,不同杀菌剂对褐斑病菌菌丝生长和孢子萌发抑制作用不同。对褐斑病菌菌丝生长具有强烈抑制作用的杀菌剂为苯醚甲环唑、咪鲜胺、代森锰锌及嘧霉胺,其EC50分别4.21、4.67、5.59 μg/mL及4.11 μg/mL。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂及防治卵菌病害的药剂对褐斑病菌菌丝生长几乎没有影响。烯肟菌酯、福美双、代森锰锌、烯酰吗啉、百菌清和多菌灵对褐斑病菌孢子萌发具有强烈抑制作用,其EC50分别为3.34、6.62、0.28、3.54、0.53 μg/mL及0.26 μg/mL。50 μg/mL的嘧霉胺虽对孢子萌发抑制作用较小,但10 μg/mL时即可导致萌发的芽管出现明显卷曲、畸形。     

常用杀虫剂对半闭弯尾姬蜂成虫和蛹的安全性

选择11种常用杀虫剂,采用药膜法与浸渍法,分别测定了其在田间防治小菜蛾推荐使用浓度下对半闭弯尾姬蜂成虫和蛹的致死率。测定结果表明,97%杀螟丹可湿性粉剂、5%高效氯氰菊酯乳油、10%虫螨腈乳油、5%氟虫腈乳油、2.5%多杀菌素悬浮剂的毒性较高,处理24h后的死亡率分别为100%、100%、100%、100%和79.6%;而5%茚虫威乳油、5%氟啶脲乳油、10%虫酰肼乳油的毒性较轻,24h后的死亡率分别为37.0%、36.1%和33.3%;、20%丁醚脲乳油、3%Bt可湿性粉剂和2%阿维菌素乳油对成虫无毒,24h后死亡率分别为27.8%、13.3%和3.3%,与对照无显著差异。不同供试杀虫剂制剂对寄生蜂蛹的羽化率均与对照无显著差异,表明所测药剂对半闭弯尾姬蜂蛹的毒性较低。     

嗜热子囊菌JCM12803来源的阿魏酸酯酶FAE-2515酶学性质研究

阿魏酸酯酶广泛应用于食品、药品、饲料及造纸等行业,挖掘适用于工业化的阿魏酸酯酶至关重要。从嗜热真菌Thermoascus crustaceus JCM12803中克隆得到一个阿魏酸酯酶基因FAE-2515,经基因序列分析,FAE-2515 cDNA全长为1 581 bp,编码526个氨基酸和1个终止子,理论分子量大小为57 kDa,等电点为5.08。将FAE-2515成功地在毕赤酵母中实现高效异源表达,通过对重组蛋白进行酶活测定,比活为（53.653±3.451）U/mg,Kcat/Km值为1.423,最适pH为6.0,最适温度为55℃,60℃处理1 h之后还能保持60%的酶活,热稳定性较已报道的同类酶更为稳定。以阿魏酸甲酯为底物时酶活表现为最高,以硝基苯棕榈酸酯为底物时几乎没有酶活。金属离子K+、Ca2+、Na+对该酶有显著的促进作用,Fe3+、Zn2+对该酶有轻微抑制作用,Mn2+、Cu2+对该酶有显著的抑制作用。综上,该酶在造纸工业和动物饲料制备工业中具有一定优势。     

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。     

山羊β-防御素表达载体的构建及产物的活性鉴定

对山羊GBD-1进行载体构建,转到毕赤酵母中高效表达并对表达产物的生物学活性进行鉴定,为进一步研究防御素抗菌机理打下基础。根据GenBank中山羊β-防御素的CDS区序列,设计含有特殊酶切位点的引物扩增到目的片段,将该片段克隆到真核表达载体pPICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA/GBD-1,电转化到毕赤酵母中进行诱导表达。测序结果表明扩增的目的片段为114 bp,编码38个氨基酸,经Tricine-SDS-PAGE电泳验证在4.3 KD处有目的蛋白;作抑菌实验发现,重组蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果。山羊防御素成功地在毕赤酵母中诱导表达,为进一步研究GBD-1的蛋白纯化以及抗菌机理打下基础,并为利用基因工程方法生产防御素提供理论依据。     

热稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。将热稳定性提高的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,发现其毕赤酵母重组菌株经摇瓶诱导培养120 h后,培养上清的酶活力达到0.7 U/mL,蛋白分泌量是野生型的14倍,SDS-PAGE电泳图中培养上清有明显的蛋白质条带,进一步证明了分泌效率提高,该结果表明提高蛋白质的热稳定性可以作为提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌效率的一条有效途径。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。     

弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达

以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍.     

坏死杆菌白细胞毒素作为腐蹄病亚单位疫苗候选抗原的研究前景

腐蹄病（foot rot）是侵害反刍动物趾间皮肤及深层软组织为主的,严重影响奶牛生产性能和产奶质量的一种常见疾病。由于传统的灭活菌苗具有免疫效果差、副反应严重及大量生产困难等缺点,使腐蹄病基因工程疫苗的研究成为热点。笔者对坏死杆菌白细胞毒素作为腐蹄病亚单位疫苗候选抗原研究的最新进展进行综述,希望为腐蹄病亚单位疫苗的研究提供参考。