利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系.利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库.综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5x106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%.本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础.     

东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因，探索其分子机理，我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织／器官裂解物共培养，比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果，之后，以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针，以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫（44d）噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选后，随机挑取92个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析，获得了19个有效EST序列，其中15条EST序列与已知基因或表达序列标签同源，4个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性，为新的表达序列标签。对19个有效EST编码蛋白的功能预测结果显示，其中6个为卵壳蛋白（Eggshell protein）相关基因，10个EST及其编码蛋白的功能与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示，东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达，进而影响血吸虫的发育，可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。     

应用酵母双杂交系统初步筛选IBDV VP2结合蛋白

用RT-PCR扩增VP2 cDNA并克隆入诱饵载体pSos,与鸡法氏囊cDNA文库中分离的质粒DNA共转化cdc25H,筛选阳性酵母克隆;用酵母质粒DNA转化大肠杆菌,提取质粒再分别与诱饵载体pSosVP2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交系统对阳性克隆进行验证.对阳性克隆的插入片段进行序列分析,根据生物信息学分析结果初步确定IBDV VP2结合蛋白编码基因.结果显示,经酵母双杂交共筛选出48个候选阳性克隆,分别转化酵母菌,经酵母双杂交验证后,获得阳性克隆19个.进一步的序列分析显示,在19个插入序列中,共编码8种不同的多肽,分别是Ras超家族中的RRAS2、Rit1和N-Ras,肿瘤相关蛋白TCTP和PARP14,抗病毒Mx蛋白,LAMB3蛋白以及蛋白激酶PRKX.VP2候选结合蛋白的获得为IBDV受体、诱导细胞凋亡或逃逸宿主抗病毒机制等研究奠定了基础.     

角毛壳菌降解粗纤维基因的筛选

以角毛壳菌菌丝体为材料,构建cDNA文库并进行了部分表达序列标签(ESTs)的分析。文库的滴度为1.02×106pfu/mL,重组率为95.3%,插入片段平均长度大于1.2kb。在cDNA文库中随机选择克隆从5′端测序得到1219个高质量ESTs,拼接为804条独立基因。其中460条(57.2%)与NCBI中非冗余蛋白质库(NR)已知基因有不同程度同源性的代表已知功能基因,344(42.8%)条独立基因与NR库中基因没有显著同源性的代表未知功能新基因。从已知基因中鉴定出了降解粗纤维的基因:β-1,4-内切葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、β-内切木聚糖酶基因、木糖苷酶基因、漆酶基因。     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料,采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN;用磁珠法分离得到纯化的mRNA;在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA;经与质料载体重组和转化大肠杆菌,成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库.经检测,文库存容量达106,重组率为88.21%.测序结果表明:克隆片段长度一般都大于600 bp,说明构建的文库质量较高,能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要,为进一步研究奠定了很好的物质和技术基础.     

Construction of cDNA Library from Populus euphratica

1 Introduction Populus euphratica is a salt tolerant tree species, which is mainly distributed in the desert regions in northwest China (Wei 1993). Moreover, it is the only large tree species, which can survive and develop into forest in these arid and saline-alkali areas. P. euphratica forest plays a very important role in restraining the expansion of desert, maintaining ecological environment in west China, protecting the biological diversity and raising the local people抯 living standard…     

桃酵母双杂交cDNA文库的构建及生长素响应因子4互作蛋白的筛选

[目的]为解析桃果实发育成熟的机制,通过构建成熟期前后桃果实的酵母双杂交cDNA文库,筛选生长素响应因子4的互作蛋白,探究生长素响应因子4对桃果实成熟过程的调控作用.[方法]以硬溶质桃(Prunus persica L.)'突围'为材料,提取果皮的总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库,采用Mating法筛选生长素响应因子4的互作蛋白.[结果]构建的酵母双杂交cDNA文库的总库容量1.6×107CFU,重组率100％,插入片段平均长度大于1 000 bp.构建诱饵载体pGADT7-PpARF4重组质粒,在桃果实酵母双杂交cDNA文库中筛选互作的靶蛋白,共获得有潜在互作的蛋白26个,主要功能涉及信号转导与胁迫响应、器官的形成、大分子代谢及蛋白合成与修饰因子.[结论]试验建立的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整性较好,为后续筛选果实成熟相关蛋白奠定基础.     

羊驼皮肤中肌钙蛋白C(TnC)基因表达分析

从羊驼皮肤cDNA文库中筛选到TnC基因的克隆,经PCR鉴定并测序得知:克隆大小为722 bp,含有一个完整的开放阅读框(ORF)。并利用生物信息学方法对该基因进行分析,发现该基因编码160个氨基酸,为膜蛋白,部分具有高度同源性,并还有一个EFh家族的保守区域,是该蛋白的功能区域。     

专家文库

曾智勇,男,1978年9月生,四川威远人,博士,贵州大学教授、硕士研究生导师、贵州大学学术骨干、动物科学学院本科教学实验中心主任,贵阳市科技特派员。2001年毕业于四川农业大学兽医专业;2001-2006年于四川农业大学预防兽医学专业硕博连读,获农学博士学位。2006年12月毕业至今,于贵州大学动物科学学院从事教学科研工作。     

长白山野生膜荚黄芪cDNA文库的构建与初步鉴定

以长白山区野生膜荚黄芪根和叶为试材,参照TRIzoL说明书提取总RNA,采用SMART技术构建其全长cDNA文库,为分子水平上揭示膜荚黄芪次生代谢调控机制提供充足的基因资源。结果表明:原始文库滴度为4.8×105 cfu/mL,重组率接近99.1%,插入片段大于0.5kb,平均大小1.54kb。所构建的cDNA文库的库容量、克隆效率和全长率满足挖掘膜荚黄芪次生代谢相关基因的要求。