细菌耐药机制及其控制对策

随着抗菌药物在畜牧养殖业中的广泛应用,细菌的耐药性越来越引起人们的重视,其极大地影响食品安全,危害人类身体健康.作者就近年来国内外对细菌的耐药机制、基因机理及对耐药性的控制对策等方面作了阐明和综述.     

三江白猪氟烷基因频率分析

本试验随机抽取216头30日龄左右的三江白猪,从外周血液中提取基因组DNA,经纯化后应用所设计的引物进行PCR扩增,酶切鉴定后分析三江白猪氟烷基因(RYR1)的基因与基因型频率.结果表明PCR反应条件优化后,扩增出659 bp的特异性基因片段,经Hha Ⅰ和HgiAⅠ两种内切酶消化后,发现三江白猪T/T(Haln/Hal)基因型频率为4.16%;C/C(HalN/HalN)型为88.43%;C/T(HalN/Haln)型为7.41%.HalN基因频率为92.13%,Haln基因频率为7.87%.此结果表明,三江白猪中氟烷敏感基因频率和基因型频率均较低,可以通过标记辅助选择方法很快予以剔除.     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒分离株S1基因全序列分析

采用RT-PCR技术,分别以DRV-YH、DRV-YJL两株中国禽(番鸭)呼肠孤病毒RNA为模板,扩增了S1全基因的cDNA片段.将S1 cDNA克隆到T载体后进行序列测定,测序结果表明所扩增的cDNA片段长1643个核苷酸,包含了完整的S1基因的三个开放阅读框架(ORF1,ORF2和ORF3)和基因两端的非编码区.核苷酸序列比较分析结果表明:DRV-YH与ARV-S1133,176分别有6个,10个核苷酸的差异,DRV-YJL与ARV-S1133,176分别有8个,12个核苷酸的差异,DRV-YH与DRV-YJL有4个核苷酸的差异.     

F18ac菌毛A亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的F18ab菌毛A亚单位(FedA/ab)的基因(fedA/ab)[1],设计一对引物,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌2134P株[2]、8199株[3]、8813株[3]中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒T2134PA、T8199A、T8813A.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该3个序列大小均为516bp,与fedA/ab(513bp)具有较高的同源性,分别为96.3%、96.5%、95.9%,推导的Fed/ac氨基酸序列与FedA/ab同源性分别为93.0%、93.6%、92.4%.数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛A亚单位(FedA/ac)的基因(fedA/ac).     

一株禽流感病毒全基因的序列分析

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA分别进行扩增,然后将其克隆到PMD18-T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的8个基因片段与以下毒株各个基因的相应序列进行比较分析:Duck/HongKong/Y280/97(DHKY280/97)、Duck/HongKong/YT439/97(DHKY439/97)、Quail/HongKong/G1/97(QHKG1/97)、A/Chicken/Beijing/1/94(CBJ1/94)、Chicken/HongKong/G9/97(CHKG9/97)、A/Turkey/California1/66(TC/1/66).结果表明:我们克隆到的TW1/66株的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框架:TW1/66的各基因与TC/1/66株相应各基因同源性最高(NS基因除外,同源性只有(67.4%).与其它各毒株各基因同源性均较低,但与DHKY439/97各基因同源性高于与DHKY280/97、QHKG1/97、CBJ1/94、CHKG9/97各基因同源性.     

JS/1/97/Go株GPMV NP基因的克隆、序列分析

根据GenBank中发表的GPMV SF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1470bp大小相符的片断,将此扩增产物克隆入PMD18-T载体,进行序列测定和分析.结果表明:所扩增的NP基因的核苷酸长为1 470bp,共编码490个氨基酸.同源性分析表明:JS/1/97/Go与国内的SF02株的NP基因核苷酸同源性为98.6%,氨基酸同源性为99.6%.由此可见,鹅副粘病毒JS/1/97/Go分离株与SF02株的亲缘关系较近,同属于新城疫Ⅶ型基因.而其与LaSota株的核苷酸同源性为85.2%,氨基酸同源性为90.8%.说明该毒株相对于经典的NDV在NP基因上已发生了较大的变异.     

三株广西狂犬病病毒NS基因和M基因的克隆与序列分析

本研究设计了一对特异性引物NSM1/NSM2,对三株广西狂犬病病毒NS和M基因同时进行了RT_PCR扩增、克隆和测序。同源性分析表明,三株广西野毒NS基因核苷酸同源性为87.2%~98.4%,M基因核苷酸同源性为90.1%~99.7%;与固定毒和狂犬病相关病毒比较,NS基因分别为79.9%~82.8%和69.7%~71.0%;M基因的分别为82.8%~87.8%和75.0%~77.8%。三株野毒NS基因氨基酸同源性为93.3%~98.7%,M基因氨基酸同源性分别为97.5%~100%。表明广西各地毒株之间亲缘关系不同,但最为相近;与狂犬病固定毒株亲缘关系较远;与狂犬病相关病毒亲缘关系最远。     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株S4基因序列分析

应用非免疫番鸭胚增殖中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株,用LSTRIAZOL提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株S4基因节段cDNA.将S4cDNA克隆到PMDl8-T载体上,并进行了鉴定和核苷酸序列测定.序列分析结果,克隆的S4cDNA共1 124bp,包括非编码区和完整的阅读框架.分子进化系统分析表明该毒株与禽呼肠孤病毒(鸡呼肠孤病毒)的亲缘关系较远,DRV-YB与DRV-89330同缘率为93.3%.     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70.以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-70和pET28a( ),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达载体pET28a-70.将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25Ku外源蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答

以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)～141-160(20AA)～21-40(20AA)～141-160(20AA)的2020-2020VP1融合基因表达载体r2020-2020,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18Ku.动物实验表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应及抗FMDV中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值.