马铃薯致病疫霉EST-SSR PCR反应体系的优化

由致病疫霉(Phytophthora infestans Montagne de Bary)引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯生产的最严重病害。试验以致病疫霉菌株HH06-23为模板,以Pi08N为引物,研究致病疫霉EST-SSRPCR反应体系中各主要成分和退火温度对扩增结果的影响。优化后的PCR反应体系为:25ng模板DNA,0.5mmol·L-1dNTPs,2μL10×Buffer(Mg2+Free),1.75mmol·L-1MgCl2,15pmol引物,1.2UTaqDNA聚合酶,加ddH2O至20μL;同时确定引物退火温度为63℃。PCR体系稳定性试验结果表明,优化后的致病疫霉EST-SSRPCR反应体系稳定、可靠,适合进行致病疫霉群体遗传多样性研究。     

Study on Transformation of Oriental Hybrid Lily by Agrobacterium-mediated

An efficient procedure was described for the transformation of the monocotyledonous oriental hybrid lily, Lilium cv. Siberia. by Agrobacterium-mediated genetic transformation via leaves regeneration, The leaves of leaflets which derived from bulbs were sliced into 1.0 cm long and were co-cultivated with A. tumefaciens strain LBA4404/pB2AE12, which harbored a vector carrying the neomycin phosphotransferase, DREB2A genes in the T-DNA region. The suitable genetic transformation condition was determined as follows： the bacterial concentration reached 0.5-0.6 （OD600）, 15 min infection time, 20 mg.L^-1 acetosyingone, and 10.6 mmol.L^-1 NH4NO3 medium was used for co-cultivation 3 days, delayed 7 days for selecting by 30 mg.L^-1 kanamycin containing regeneration medium. Efficient shoot regeneration was observed on MS medium supplemented with 1.0 mg.L^-1 naphthaleneacetic acid, 0.5 mg.L^-1 benzyladenine and 0.1 mg.L^-1 Kinetin after about 6 weeks culture. The presence ofDREB2A gene in the genomic DNA of regenerated plants was detected by means of PCR analysis.     

日粮添加纳豆芽孢杆菌对断奶后犊牛胃肠道纤维分解菌的影响

研究日粮中添加纳豆芽孢杆菌对断奶后犊牛瘤胃及肠道中主要的纤维分解菌琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flave faciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)和脂解厌氧孤杆菌(Anaerovibrio lipolytica)数量的影响.选取8头断奶犊牛,处理组犊牛日粮中添加含菌量为1010 CFU的纳豆枯草芽孢杆菌菌液.采集犊牛瘤胃食糜提取总DNA,利用种属特异性引物和实时荧光定量PCR计算菌群数量变化.结果表明,脂解厌氧弧杆菌是对照组犊牛消化道中的优势纤维分解菌;琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌存在于除十二指肠之外的其他肠道中.与对照相比,在处理组瘤胃、空肠和回肠中都检测到了黄色瘤胃球菌,犊牛其他肠道部位的纤维分解菌的数量均有增加,回肠中琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌及溶纤维丁酸弧菌的数量分别比对照组增加了69.3%、86.2%和76.5%.本研究表明纳豆芽孢杆菌促进了以上几种纤维分解功能菌群在断奶后犊牛消化道中的定植和生长.     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

粗毛淫羊藿内转录间隔区序列扩增条件的优化

用CTAB法提取粗毛淫羊藿叶片DNA,进行内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列PCR扩增试验,通过单因子试验研究了退火温度、Mg2+浓度、TapDNA聚合酶浓度、dNTP浓度对ITS-PCR反应的影响,并通过各因子的组合研究,建立了适宜于粗毛淫羊藿ITS分析的扩增体系:25μL体系中2.5μL10×buffer、1μL模板DNA、1.0mmol/LMgCl2、1.5mmol/L dNTP、1.25UTaq酶、0.4μmol/L ITS4、ITS5.PCR反应程序为95℃5min;94℃30 s,52℃45 s,72℃1min,共35个循环;72℃7min.粗毛淫羊藿ITS扩增条件的优化,可以为淫羊藿属遗传多样性的研究及分子鉴定奠定基础.     

3S集成野外地物几何空间信息实时获取

在指出传统地物几何和空间信息获取弊端的基础上,利用ESRI公司的移动地理信息系统软件ArcPad,对野外地物的几何和空间信息的获取提出了新的思路,并指出这种方法具有非常广阔的应用前景。     

适于长竹蛏的ISSR反应体系的优化

[目的]以长竹蛏基因组DNA为模板,探讨利用简单重复序列区间分子标记技术进行PCR扩增的最优条件。[方法]采用单因素比较试验,分析了Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响。[结果]长竹蛏的ISSR反应体系包括10×Buffer,2.5 mmol/LMg2+,0.25 mmol/L dNTP,0.5μmol/L ISSR引物,0.040 U/μlTaqDNA聚合酶,1.6 ng/μl模板DNA。[结论]优化后的反应体系适于长竹蛏的ISSR-PCR扩增。     

猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR、鉴别方法的建立与应用

 【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg 病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3％（115/122）,阳性和阴性符合率分别为86.4％（38/44）和98.7％（77/78）,Kappa值为0.87＞0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒,且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。     

转基因作物及产品检测技术研究进展

随着转基因技术的迅猛发展,转基因作物及其产品的安全性问题受到广泛关注,世界各国纷纷加大了对转基因生物及其产品的管理力度。转基因检测是转基因安全管理的技术保障,本文就国内外转基因作物及产品的检测技术进行了综述,重点介绍了目前使用较广泛的PCR、ELISA等转基因检测技术的原理和特点。提出了今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。     

基于α-乳白蛋白基因序列的牛奶过敏原PCR检测

采用收集牛奶中脱落体细胞的方法提取牛奶DNA,针对牛奶过敏原蛋白α-乳白蛋白基因序列设计引物α-La-F/R,筛选适宜的实验条件,建立了检测牛奶过敏原的PCR方法.结果表明:PCR反应的最佳退火温度为56.5℃,引物浓度0.15μmol/L,循环数35,进一步实验表明该方法特异性良好,检测灵敏度可达到0.04ng DNA.将建立的PCR方法应用于10种食品的牛奶过敏原检测,实验结果与商品标示一致,表明该方法具有较高的准确性和可靠性,适用于实际商品中牛奶过敏原的检测.