刺参核糖体蛋白L17基因(RPL17)全长cDNA克隆及组织表达

核糖体蛋白除组成核糖体、参与蛋白质合成之外,还作用于细胞的分裂、增殖、分化、凋亡、发育调控等过程.为了研究核糖体蛋白基因在刺参中的生理功能,本研究采用全长cDNA克隆技术首次从刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆出核糖体蛋白L17基因(ribosomal protein L 17,RPL17)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ922561).该基因cDNA全长643 bp,包括33 bp的5’-UTR,58 bp的3’-UTR,开放阅读框552 bp,编码183个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为21.5010kD,理论等电点(pI)为10.29,总平均亲水性(GRAVY)为-0.964,为不稳定的亲水蛋白.在NCBI网站上经Blastn和Blastx比对分析,发现该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在70％以上,其中与紫海胆(Stron-gylocentrotus purpuratus)的同源性分别为75％和81％.二级结构预测结果:α螺旋占36.61％;β折叠占7.65％;无规卷曲占42.08％;其余13.66％为延伸链.蛋白功能位点分析显示其含有1个核糖体蛋白L22信号位点和9个磷酸化位点,其中cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点3个,蛋白激酶C磷酸化位点4个,酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点2个.构建的系统进化树显示,刺参与同为棘皮动物的紫海胆聚为一支,分子进化地位上关系最近,其次聚类顺序较近的为玻璃海鞘、非洲爪蟾,脊椎动物聚为一支,该结果与这些物种在生物学上的分类是较一致的.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测RPL17基因在刺参各组织中的表达,结果表明,RPL17基因在体腔细胞中表达量最高,肠中次之,呼吸树中最低.体腔细胞中的表达量分别为肠、体壁、纵肌、呼吸树的5.67、21.63、43.25和346倍,与4种组织的差异均极显著(P＜0.01).另外,肠与呼吸树中的表达量差异显著(P＜0.05),其余组织差异不显著(P＞0.05).本研究结果将为进一步研究刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制提供基础数据.     

虾夷马粪海胆CYP17基因的克隆及其表达差异

采用分子生物学方法成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP17基因。该基因的cDNA全长为1 570 bp,其中开放阅读框1 482 bp,编码493个氨基酸;CYP17蛋白的相对分子质量约为55 540,等电点为8.068,信号肽断裂位点位于第18和第19个氨基酸残基之间;虾夷马粪海胆的CYP17氨基酸序列与紫球海胆S.purpuratus的同源性为97%,与光棘球海胆S.nudus的同源性为96%。用RT-PCR技术对CYP17基因在虾夷马粪海胆生殖腺不同发育时期的表达差异进行了分析。结果表明:在虾夷马粪海胆3个家系的雄性个体生殖腺中,CYP17基因在1-3家系的表达量最高,依次为10-3家系、6-2家系,而在雌性个体生殖腺中,CYP17基因在10-3家系的表达量最高,依次为1-3家系、6-2家系;在4-1家系海胆3个不同发育时期,CYP17基因在雄海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加,而雌海胆性腺在发育第430天到第447天时表达量略有增加,发育到第512天时表达量明显增加。本研究表明,CYP17基因在海胆雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性的表达量明显高于雌性。     

不同形状的附着基对仿刺参幼参生长的影响

在水温为9.0～16.0℃下,将体质量为(0.5±0.2)g的仿刺参Apostichopus japonicus Selenka幼参饲养在放置了混凝土制的中空型(A类)、楼层型(B类)和井字型(C类)附着基的塑料水槽(45 cm×31 cm×30 cm)中,投喂配合饲料,采用每周清洗一次附着基(A1、B1、C1组)和不清洗附着基(A、B、C组)的方法饲养80 d,研究了附着基形状及其处理方式对仿刺参幼参生长的影响。结果表明:是否清洗对仿刺参的特定生长率有极显著性影响(P<0.01),附着基形状与是否清洗的交互作用对仿刺参的特定生长率有显著性影响(P<0.05),其中B1组仿刺参的特定生长率最高,B组最低,且两组之间有显著性差异(P<0.05);定期清洗附着基的各试验组水中氨氮和亚硝酸氮含量及化学耗氧量均低于不清洗组;不清洗附着基的各组仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)的平均活性分别比清洗组高32.28%、9.17%和5.71%,而相同形状附着基的不清洗组与清洗组仿刺参的SOD活性存在显著或极显著性差异(P<0.05、P<0.01)。     

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda L-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况.结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank 中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99％、97％、99％、99％、99％、98％;通过优化反应条件,在退火温度为54 ℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因.表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株.     

仿刺参体壁创伤修复消减文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH),构建了仿刺参Apostichopus japonicus(体质量为65 ～90 g)正常体壁及创伤修复(24、48、72、96、120 h后)体壁的消减cDNA文库,利用PCR和斑点杂交技术对文库进行筛选,随机挑取的768个克隆中发现292个阳性克隆,对其中信号强度较强的224个阳性克隆进行测序,得到208个有效EST序列.经BlastX工具对获得的EST与GenBank数据库进行比对分析,结果有171个EST序列与数据库中的基因同源(e≤0.001,相似性＞40％),其中153个为未知基因,18个为已知功能或已命名基因,包括在创伤及修复的体壁中上调表达的β微管蛋白、微管蛋白α-1链、肌动蛋白、肌动蛋白ike 7B类似物、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、tRNA假尿苷合成酶A、GTP酶、细胞分裂周期2类似蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶、homeobox蛋白、延伸因子1A、核糖体蛋白L30、核糖体蛋白L17、60S酸性核糖体蛋白PO、26S蛋白酶调节亚基、泛素特异性肽酶24、大肠癌血清抗原3、清道夫受体蛋白12等.本研究结果可为探讨刺参体壁再生过程和分子机理,以及筛选刺参体壁创伤修复过程中相关功能基因的研究提供基础依据.     

3种鱼类的单个胚胎染色体标本制备方法

[目的]为建立1种准确、快捷、高效的鱼类染色体制备方法.[方法]以泥鳅、红鳍东方鲀和德国镜鲤的单个胚胎作为材料,通过秋水仙素、低渗、卡诺固定等操作制备染色体标本.[结果]3种鱼类均获得大量形态清晰、长度适中、分散良好的中期分裂相.[结论]以鱼类肌肉效应期为材料可成功制备染色体标本,为鱼类染色体标本制备提供了新方法.     

饲料脂肪水平对红鳍东方纯幼鱼生长、体组成及血液指标的影响

为研究不同脂肪水平对红鳍东方纯的影响,在18个200L圆形流水水槽中各放养体重大小接近的红鳍东方鲍幼鱼20尾,分别投喂脂肪水平为5．77％、7．71％、8．93％、11．89％、13．75％、16．42％的饲料,每个脂肪梯度设3个重复。56d饲养试验结束后,结果显示,东方纯增重率和特定生长率都呈先升高后降低的趋势。当脂肪水平为5．77％～13．75％时,饵料系数呈现逐渐降低的趋势,随着脂肪水平的进一步升高,饵料系数保持平稳,高脂肪组和低脂肪组差异显著（P〈0．05）。肝体比和脏体比都随脂肪水平升高而显著增加（P〈0．05）。肥满度的最大值出现在8．93％组,但与其他各组差异不显著（P〉0．05）。全鱼体成分分析表明,水分、灰分和粗蛋白含量随脂肪水平增加都呈下降趋势,且各组间差异显著（P〈0．05）;粗脂肪含量随脂肪水平增加,各组间显著升高（P〈0．05）。8．93％脂肪组血糖含量最高。各组谷丙转氨酶、总胆固醇和甘油三酯含量随脂肪水平增加均显著升高（P〈0．05）。结果提示,脂肪水平为8．93％的配合饲料对红鳍东方纯幼鱼的生长代谢最为有利。     

3株芽孢杆菌对刺参池塘有机物的降解效果及鉴定

为修复刺参Apostichopus japonicus养殖池塘底质环境,根据菌株对底泥中有机质(COD)、氨氮(NH_4~+-N)和亚硝酸盐(NO_2~--N)的去除率,从刺参养殖池塘底泥和商品益生菌中筛选高效降解刺参养殖池塘底质有机污染物的潜在益生芽孢杆菌,并对筛选出的优良菌株的产酶能力和降解特性进行了研究。结果表明:从分离的11株细菌中经过筛选最终获得3株优良菌株(N1、DL、R),它们能同时高效降解底泥中COD、NH_4~+-N和NO_2~--N,5 d内对COD的最大去除率分别为45.71%、23.98%、24.97%,对NH_4~+-N的最大去除率分别为60.54%、36.15%、36.74%,对NO_2~--N的最大去除率分别为52.10%、14.41%、28.82%;根据菌株生理生化特性以及16S r DNA序列分析,N1、DL、R菌株分别为白翎芽孢杆菌Bacillus baekryungensis、地衣芽孢杆菌B.licheniformis和解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens。本研究结果可为进一步开发高效的刺参养殖池塘底质有机污染物降解益生菌及复方制剂提供参考。     

芽孢杆菌L15菌株发酵培养条件的优化

芽孢杆菌L15菌株能有效降低刺参Apostichopus japonicas养殖水中的化学耗氧量(COD)和氨氮(NH+4-N)含量,促进刺参生长,为大量发酵培养L15菌株并降低培养成本,以豆粕、麦麸、玉米酒糟、棉籽粕为碳、氮源,对发酵培养L15菌株的最佳碳、氮源及其配比和最佳发酵条件(如装液量、接种量、转速等)进行了初步优化研究。结果表明:培养芽胞杆菌L15菌株的最佳碳、氮源为麦麸和豆粕,最佳添加量分别为3、2 g/L;最佳发酵培养条件为装液量1/3、接种量1%、转速160 r/min;在最佳培养基和最适培养条件下,发酵培养的L15菌株细菌数量可达1011cfu/m L,与用2216E培养基培养的L15菌株相比,在实验室条件下,对海参底泥COD的去除率虽无明显变化,但培养成本却降低了91%。研究表明,用豆泊和麦麸作为培养基培养L15菌株具有可行性,不仅细菌数量达标,且培养成本显著降低。     

虾夷马粪海胆F3代群体数量性状相关性与通径分析

为更全面地分析虾夷马粪海胆F3代的生长与性腺品质,研究测量了虾夷马粪海胆F3代群体12个家系82枚海胆的体尺性状和性腺主要营养成分,其中体尺性状包括壳性状（壳高、壳径、壳湿重、壳干重）,口器性状（口器高、口器宽、口器重）,体重和性腺湿重;营养成分性状包括性腺中的总脂肪含量、总蛋白含量和4种高不饱和脂肪酸含量(C20:4、C20:5、C22:5 、C22:6)。计算了F3代虾夷马粪海胆不同性别体尺性状、营养成分的均值、标准差和变异系数,并对数量性状间的相关关系进行了分析。结果显示：虾夷马粪海胆F3代群体各性状中,雌性群体各性状指标略优于雄性群体,但不同性别间均无显著性差异(P>0.05)。F3代虾夷马粪海胆各体尺性状之间均存在极显著的相关性(P<0.01),其中壳径与体重之间相关性最大(0.878),而口器性状与体重的相关性相对较小。营养成分方面,C20:4(AA)和C20:5(EPA)之间相关性极为显著(P<0.01);C22:5和C22:6(DHA) 之间显著相关(P<0.05),即同碳原子数的不饱和脂肪酸的含量相关显著。营养成分性状与壳高、壳径和体重的相关性均不显著(P>0.05),且多为负相关,在选择育种时应分别考虑。研究结果为虾夷马粪海胆选育潜力评估和下一步选种提供依据,为富含高不饱和脂肪酸虾夷马粪海胆培育奠定理论基础。