不同剂量环磷酰胺对昆明小鼠肝肾组织的损伤作用研究

为研究不同剂量的环磷酰胺对小鼠肝肾组织及功能的损害程度,试验选取40只5周龄健康雌性昆明小鼠,随机分为5组,除对照组外,其余4组小鼠连续3 d分别腹腔注射40、80、120及160 mg/（kg·BW）环磷酰胺溶液,注射后第7天采集肝脏和肾脏组织样品及血清,制备石蜡组织切片及透射电镜切片,观察肝脏和肾脏的组织学变化,检测血清中甘胆酸（CG）、胆碱酯酶（ChE）、血清前白蛋白（PA）、总胆汁酸（TBA）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、尿酸（UA）含量/活性。结果显示,环磷酰胺可引起小鼠肝肾组织病理损害,呈剂量依赖性,肝脏比肾脏更早出现损伤。石蜡切片及透射电镜切片观察结果显示,环磷酰胺对肝脏的毒性作用主要表现在肝索紊乱、肝血窦扩张、微胆管淤胆、门管区及中央静脉周围炎性细胞浸润及纤维增生、组织间出血、肝细胞出现脂肪变性及气球样变性,凋亡及坏死细胞增多。肾脏组织损伤主要表现在出血及纤维增生,肾小管上皮细胞胞浆空泡样变、线粒体损伤、核固缩,上皮细胞基底膜增厚。环磷酰胺对膀胱的损害不严重。与对照组相比,40~160 mg/（kg·BW）剂量组小鼠血清中ChE活性及PA水平,120~160 mg/（kg·BW）剂量组AST活性,80~160 mg/（kg·BW）剂量组BUN水平及80 mg/（kg·BW）剂量组UA水平均显著升高（P<0.05）;其余生化指标与对照组差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,环磷酰胺注射剂量在80~120 mg/（kg·BW）时可引起昆明小鼠肝脏和肾脏组织及细胞明显的病理损伤。该研究结果可为选择合适的环磷酰胺注射剂量用以制备动物肝脏免疫抑制模型提供试验依据。     

鸭胚睾丸支持细胞的分离培养与鉴定

为探究鸭胚睾丸支持细胞的分离培养方法,选取２４日胚龄的麻鸭鸭胚４０个,取出睾丸,采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶二步消化分离睾丸细胞,差异贴壁与低渗处理的方法进行纯化,于３７℃,体积分数５％二氧化碳条件下培养,最终得到纯度较高的支持细胞．经染色鉴定,发现罗丹明１２３染色显示支持细胞中富含线粒体;ＡＫＰ检测发现８０％的细胞呈ＡＫＰ阴性;吖啶橙染色显示支持细胞细胞质中富含ＲＮＡ;油红Ｏ染色显示睾丸支持细胞细胞质中含有大量脂肪滴,细胞核内可见双极小体．本试验结果说明采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶结合消化,经差异贴壁与低渗出处理纯化,可得到较高纯度的支持细胞;结合罗丹明１２３染色法、ＡＫＰ染色法、吖啶橙染色法与油红Ｏ染色法可有效鉴定支持细胞．     

南美白对虾霍乱弧菌的分离与鉴定研究

目前南美白对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）人工养殖中,病害多发,本研究从一养殖场中采集发病病虾,从患病对虾肝胰腺中分离病原菌．对分离菌株进行形态观察,生理生化测定并结合１６ＳｒＤＮＡ序列分析进行鉴定,结果表明,该分离菌为霍乱弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａ）,回归感染证明其为致病菌,可导致南美白对虾死亡．通过纸片琼脂扩散法对３２种抗生素进行药物敏感试验,病原菌对氟苯尼考、氯霉素、利福平、诺氟沙星等１０种抗生素敏感,对头孢呋辛、头孢曲松等７种药物中度敏感,对羧苄西林、青霉素等１５种药物具有抗性．通过二倍稀释法测定筛选５种常用抗生素最小抑菌浓度,结果表明诺氟沙星抑菌效果最强,最小抑菌浓度最小＜０.２４４１μｇ／ｍＬ．     

九棘鲈属鱼类DNA条形码及分子系统发育关系

为从分子水平分析九棘鲈属(Cephalopholis)鱼类物种分类关系,并验证细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)作为DNA条形码对九棘鲈属物种鉴定的有效性,采集了我国分布的12种九棘鲈属鱼类,利用PCR扩增及测序方法获得COI基因部分序列,结合GenBank下载的4种九棘鲈COI基因进行分析,利用MEGA 7.0软件计算碱基信息与遗传距离,基于最大似然法和邻接法构建分子系统进化树。结果表明,16种九棘鲈种内平均遗传距离为0.002,种间平均遗传距离为0.142,两者相差71倍,表明COI基因可作为九棘鲈属鱼类分子鉴定的条形码基因。在分子系统进化上,16种九棘鲈属鱼类聚为体色特征不同的3个类群,其中七带九棘鲈(C.igarashiensis)与卜氏九棘鲈(C.polleni)体色为多彩颜色,两者最先分化,位于进化树底部。其余的九棘鲈主要形成体色为红色与体色为褐色的类群,与形态学的分类结果一致。对于以往部分存在误鉴或同种异名分类争议的九棘鲈品种：青星九棘鲈(C.miniata)与半斑九棘鲈(C.hemistiktos)、橙点九棘鲈(C.aurantia)与黑边九棘鲈(C.spiloparae...     

蛋壳粉少量替代石粉对蛋鸭产蛋性能、蛋品质及钙代谢的影响

【目的】研究蛋壳粉少量替代石粉对蛋鸭产蛋性能、蛋品质和钙代谢的影响。【方法】试验选择80只180日龄的健康山麻鸭蛋鸭,随机分为两组,每组5个重复,每个重复8只蛋鸭。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮基础上,用2 g蛋壳粉取代饲料中等量的钙添加量。试验为期56 d,试验期间检测蛋鸭产蛋性能、蛋品质、钙沉积量、血液中钙磷含量和钙代谢相关激素水平等指标。【结果】试验组平均蛋重、蛋壳强度和蛋白高度均显著高于对照组,表明添加蛋壳粉能明显提高蛋品质量。试验组蛋壳钙沉积量、血磷含量和血浆甲状旁腺素水平显著高于对照组,试验组血钙含量为4.74(±1.17)μmol/mL,极显著高于对照组的2.79(±1.00)μmol/mL,表明蛋壳粉更有利于钙沉积,能明显提高血液中钙磷含量和甲状旁腺素水平。【结论】蛋壳粉少量替代石粉可促进蛋鸭钙吸收代谢和蛋壳钙沉积,提高平均蛋重,改善蛋品质。     

诺如病毒P-partical-GnIH抗原制备及抗原性初步检测

为探索调控家鹅繁殖性能的技术,本研究通过设计合成鹅促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）序列片段,酶切后连接到诺如病毒（Nov）P基因重组pEGX-4T-1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌重组质粒,并通过测序和酶切进行验证。将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western blotting检测重组蛋白表达。进一步在不同IPTG浓度及诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件,在最佳条件下的诱导菌液经过离心收集菌体,并超声波破碎离心后对重组蛋白可溶性进行分析。利用xTractor Buffer和Glutathione Superflow树脂对重组蛋白进行纯化,并使用自制的抗GnIH鹅血清及抗鹅二抗通过Western blotting检测重组蛋白。结果显示,重组质粒Nov P-partical-GnIH经双酶切鉴定获得大小约为96 bp的目的基因条带,进一步测序结果证明重组质粒构建成功。诱导表达的重组蛋白分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导2 h条件下表达量最高;菌体超声破碎后经SDS-PAGE检测,重组蛋白主要表达在沉淀中。重组蛋白与GST单抗及抗GnIH阳性血清均能反应,表明此重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。本研究通过对Nov P-partical-GnIH蛋白原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的重组蛋白,将有助于进一步建立家鹅的繁殖性能免疫调控方法,为提高繁殖性能及调控繁殖机制的研究奠定基础。     

甘草酸二铵抗流感病毒的作用机制

甘草酸作为甘草的主要生物活性成分,已经被证实具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎和抗病毒活性。本研究初步探讨了甘草酸二铵(DG)对流感病毒的抗病毒作用及其机制,证实250 mg/L DG即可明显抑制流感病毒复制,并且其抗病毒作用具有剂量依赖性。DG对流感病毒复制周期的影响结果显示,DG主要抑制流感病毒的复制阶段,而对吸附和进入细胞的过程没有影响。进一步研究表明,DG一方面可以上调IFN-γmRNA表达水平,通过其免疫调节功能抵抗流感病毒感染;另一方面下调炎症因子TNF-αmRNA表达水平,减轻其诱导的炎症反应,降低宿主的免疫损伤。本研究结果显示DG可作为潜在的抗流感病毒药物,为抗流感病毒药物的筛选奠定基础。     

鲫鱼肌间刺形成基因SOST的克隆表达研究

硬化蛋白(Sclerostin,SOST)是一种由骨细胞特异性分泌用于负调节骨形成的因子,为探究硬化蛋白SOST在鲫鱼肌间刺形成中的调控作用.本研究对鲫鱼SOST基因进行扩增,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SOST,转化感受态细胞BL21(DE3),利用IPTG诱导蛋白表达,分析诱导时间与诱导浓度对SOST蛋白表达的影响,并比较SOST基因内源信号肽片段切除前后的表达效果.结果显示,鲫鱼SOST基因序列为636 bp,蛋白质分子量约为38 kDa.随着时间的递增,蛋白表达量逐渐增大,诱导时间为4 h左右表达量达到最高;不同IPTG诱导浓度对蛋白的表达效果影响不大,而信号肽的存在会强烈抑制该蛋白的表达.研究结果为进一步分析SOST基因在鲫鱼肌间刺形成过程中的影响提供理论依据.     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

Clock基因在不同繁殖时期雌性马岗鹅中的组织表达

为研究Clock基因对鹅繁殖周期的影响,选取产蛋高峰期、休产期和就巢期的2.5年龄雌性马岗鹅各6只,采集下丘脑、垂体和卵巢组织样品,克隆鹅的Clock基因,并采用实时荧光定量PCR的方法检测其在不同繁殖周期的表达水平.通过克隆获得马岗鹅Clock基因cDNA序列2 905 bp,基因组序列全长41 039 bp,含22个外显子,21个内含子.比对分析发现该序列包含了Clock基因的全部编码序列,共2 574 bp,编码857个氨基酸.氨基酸序同源性比对发现,鹅Clock基因与其他禽类的同源性均超过96%,在物种间的保守性高.产蛋高峰期时Clock基因表达水平在下丘脑、垂体和卵巢组织中均高于休产期和就巢期,其中在下丘脑(P0.01)和卵巢组织(P0.05)中差异均显著,而休产期和就巢期的表达水平差异无统计学意义(P0.05).研究发现Clock基因在产蛋高峰期的下丘脑和卵巢中高表达,说明该基因可能参与鹅繁殖节律的调控.