我国刺参养殖存在的主要问题与疾病综合防治技术要点

从养殖设施、养殖工艺、生态环境、种参和种质等多方面进行了全面的分析和讨论，深入剖析了目前刺参养殖业中存在的主要问题，并根据我国养殖刺参的发病特点和发展趋势，提出了相应的对策，阐明了海参疾病综合防治技术的要点。     

维生素E及脂肪源对大菱鲆非特异性免疫的影响

在大菱鲆饲料中分别添加鲤鱼鱼油及花生油作脂肪源,每种脂肪中添加两个水平的维生素E（8mg／kg和300mg／kg维生素E醋酸酯）,饲养大菱鲆84d,探讨其对大菱鲆非特异性免疫的影响。结果发现,（1）以鲤鱼鱼油为脂肪源的添加高剂量的维生素E能提高大菱鲆血清补体活性,而以花生油为脂肪源的饲料添加高剂量的维生素E不影响大菱鲆血清补体活性;（2）以鲤鱼鱼油和花生油为脂肪源的饲料添加高剂量的维生素E不影响大菱鲆中性粒细胞的吞噬率及白细胞总数;（3）以鲤鱼鱼油为脂肪源的饲料添加高剂量的维生素E能提高大菱鲆的溶茵酶活性,但随着时间推移其影响减弱;（4）饲喂n-3HUFA含量高的饲料,对大菱鲆腹水病的抵抗能力高于n-3HUFA含量低的饲料。     

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上,筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测,并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示,13个位点中有3个单态性位点,其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)～0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)～0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(H_o)介于0.031(SNP113)～0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)～0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离HardyWeinberg平衡。QTL验证结果表明,SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型,发现二倍型K_1(CC AA TT)抗病力最强,S_1(CC AA)、S_3(CC AC)在生长方面优势显著,相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

黄连素对海水病原菌的杀灭效果及药效稳定性

为探讨黄连素对主要海水养殖病原菌的抑菌作用,采用二倍稀释法测定黄连素对迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌等10种病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度,并以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种为指示菌,研究黄连素在不同温度、存储条件和金属离子影响下的药效稳定性。试验结果显示,黄连素对10种海水养殖病原菌均具有较好的抑菌及杀菌作用,最小抑菌质量浓度为64～256mg/L,最小杀菌质量浓度为256～1024mg/L。其中,黄连素对大菱鲆弧菌和溶藻弧菌抑菌作用最明显,最小抑菌质量浓度为64mg/L;对鳗弧菌、大菱鲆弧菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鲨鱼弧菌和轮虫弧菌杀菌作用最强,最小杀菌质量浓度为256mg/L。质量浓度为512mg/L的黄连素溶液分别在20、40、60、80、100、121℃处理下作用30min,对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的杀菌率均超过99%,将20、60、100℃处理的黄连素溶液于室温下避光存储35d,对指示菌的杀菌率依然大于99%,显示其良好的药物稳定性。金属离子的影响试验也证实,水环境中的Na+、Mg²⁺、Ca²⁺、K^+等离子对黄连素的杀菌效果无显著影响。因此,黄连素适宜作为防治水产动物细菌性疾病的临床药物。     

养殖大菱鲆黑瘦症的病原菌鉴定及杀菌中草药筛选

从患黑痩症的大菱鲆幼体内分离得到一株优势菌株,人工感染实验证实其为大菱鲆致病菌,并经过生理生化及16SrDNA序列分析鉴定为灿烂弧菌Vibrio splendidus。组织病理学显示,病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道及脑均呈现不同程度的组织破坏。用煎煮法提取11种常用中草药成分,测定该致病菌对中草药的杀菌效果。实验表明,五倍子和白头翁的杀菌效果最好,黄柏、穿心莲次之,当归、党参、杜仲、秦皮、金银花、乳香和没药的杀菌效果最差。以五倍子、白头翁为主要成分的初步治疗试验证明,药浴和口服给药可有效治愈大菱鲆苗期的黑瘦症。     

池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物、附着基和底泥中的菌群结构及其相关性

2014年10月,利用 PCR-DGGE 技术分析了标准化养殖池塘中仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物及附着基和底泥中细菌的菌群结构及其相关性。结果显示,仿刺参肠含物、附着基、底泥中细菌多样性较高,分别平均获得30.00±1.00、15.33±1.70、21.67±2.62条带,肠含物中细菌种类数显著高于附着基和底泥。聚类分析和戴斯系数表明,不同池塘的仿刺参肠含物样本单独聚为一支,相似性达到0.785,附着基和底泥样品聚为一支,平均相似性达到0.532。不同样品 DGGE 图谱中20条优势条带的切割、克隆、测序,共获得了20条细菌序列,表明肠含物细菌种类以聚球藻属(Synechococcus sp.)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫叠球菌属(Desulfosarcina sp.)、极地杆菌属(Polaribacter)、Algibacter sp.为主,附着基中主要以 Robiginitalea sp.和 Silicibacter sp.为主,底泥样品中主要以假单胞菌属(Proteobacterium）、噬胞菌属(Cytophaga）、Desulfosarcina sp.为主,肠含物中细菌特有种类的分离与鉴定为仿刺参养殖潜在益生菌的开发提供基础数据。     

养殖刺参早期发育阶段体内可培养细菌的菌群特征及其与环境菌群相关性分析

采用传统细菌培养方法,对养殖刺参(Apostichopus japonicus)早期发育各阶段幼体体内及环境(投入饵料及培育用水)菌群的组成与结构展开研究,对分离的优势细菌进行分子鉴定,在此基础上,进行了刺参幼体体内菌群结构与环境菌群结构相关性分析。幼体各发育期的细菌培养结果显示,在幼体开口前的各发育时期(性腺、卵、受精卵、原肠胚)均无可培养细菌,在投饵以后,耳状幼体、樽形幼体体内可分离到可培养细菌,幼体发育到稚参以后,消化道可培养细菌总数急剧增加,并在4月龄时达到108 CFU/g数量级。在幼体体内可培养细菌中,弧菌(Vibrio)占比为2.2%~77.3%。对环境菌群的细菌培养结果显示,培育用水中细菌含量变化不显著,随着幼体发育期饵料的转变,不同时期饵料中细菌含量差异显著。整个养殖系统中共分离到65株优势细菌,16S rDNA鉴定结果显示,所分离的65株优势菌鉴定为14个属43种细菌。相关性分析结果显示,随着幼体的发育,生物饵料中的细菌对消化道中的菌群结构影响越来越大。本研究结果为解析刺参消化道菌群的形成过程和演替规律以及养殖用益生菌的筛选与应用奠定了基础。     

养殖长茎葡萄蕨藻黑褐病的病原学研究

本研究从大连某养殖场发生黑褐病的长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)分离得到1株优势菌株CL2017070801002。采用该菌株浓度为103~108 CFU/ml的菌液浸泡感染长茎葡萄蕨藻,在7 d内,每个感染实验组的藻体都出现了不同程度的黑褐色典型发病症状,人工感染实验结果表明,CL2017070801002对长茎葡萄蕨藻有致病性。扫描电镜观察发现,藻体细胞壁表面聚集大量细菌,随着侵染时间加长,细胞组织破裂死亡。研究表明,CL2017070801002为本次发现的长茎葡萄蕨藻黑褐病的病原。结合革兰氏染色、生理生化特征和16S rDNA序列进化树分析结果,将该菌株鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。药敏实验结果显示,该菌株对氯霉素、四环素、氟罗沙星、强力霉素和氟苯尼考等药物高度敏感,对庆大霉素、克拉霉素等药物中度敏感,对青霉素、头孢氨苄、头孢拉定等药物不敏感。本研究为长茎葡萄蕨藻的细菌性病害防治提供了有益参考。     

地榆醇提物对对虾致病菌VPAHPND生长影响及最适内参基因的筛选

为筛选适用于研究地榆(Sanguisorba officinalis L.)对对虾急性肝胰腺坏死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus, VPAHPND)抑制机理的内参基因,本文探究了地榆醇提物胁迫下VPAHPND生长的变化,并利用qRT-PCR技术探究了该条件下VPAHPND中 6种常见内参基因(rec A、pvs A、pvu A、gapdh、16S rRNA和rpo S)的表达情况,利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。结果显示,地榆醇提物能抑制VPAHPND的生长,且抑制效果与浓度呈正相关。在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这 6种内参基因扩增产物特异性良好,其中,Ct值变化差异最小的为16S rRNA (CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A (CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中,GeNorm给出的稳定性排序为rpo S = 16S rRNA > gapdh > rec A> pvu A > pvs A;Norm Finder结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Best Keeper结果为16S rRNA > rpo S > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Delta Ct结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo S > gapdh > 16S rRNA > pvu A > pvs A > rec A。本研究根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo S和gapdh作为该条件下内参基因。本研究为以地榆为核心药物的AHPND防控技术的建立和从基因表达角度研究地榆对VPAHPND的作用机理提供了基础。     

刺参“参优1号”苗种在不同pH条件下的代谢特征和适应性研究

为研究刺参(Apostichopus japonicus)"参优1号"苗种的适宜pH及耐受范围并解析其对水体的酸碱性适应机制,本研究测定了pH 6.5~10.0条件下该良种苗种的生长、存活、呼吸代谢以及非特异性免疫酶活性的差异。结果显示,在pH 6.5~9.5范围内,30 d实验周期内苗种的存活率均为100%,而在pH 10.0条件下苗种全部死亡。在pH 7.5~8.5范围内,苗种特定生长率(SGR)为正值,且在pH为8.0时SGR最高,达到0.541%/d,而在pH低于7.0和高于9.0时,SGR为负值,苗种为负生长。对不同pH条件下的耗氧率(R_O)和排氨率(R_N)的测定结果显示,随pH的变化,R_O和R_N均呈现以pH 8.0为波谷的"V"型变化,在pH 8.0条件下的R_O和R_N分别为19.07和1.34μg/(g·h)。不同pH实验组刺参苗种的氧氮比(O/N)均在11左右,O/N随pH变化无显著差异(P>0.05)。pH的升高和降低会引起刺参体腔液中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性显著升高(P<0.05),在苗种适应pH胁迫过程中,各pH组超氧化物歧化酶活性的峰值一般在第0天出现,而溶菌酶的活性峰值在第10天出现。研究表明,刺参"参优1号"可存活的pH范围为6.5~9.5,适宜生长的pH范围为7.5~8.5,pH变化会导致苗种呼吸代谢和免疫酶活性的改变。本研究结果将为刺参"参优1号"苗种的科学化推广提供依据。