对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立与应用

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×100和4.31×101 copies/μL,样品平均检测时间为26 min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2 h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高,更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室,更符合养殖基层的现场快速检测需求,为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。     

5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae)的Mcp基因作为靶基因,设计特异性引物,通过优化反应体系和条件,并在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。结果显示,本研究所建立的检测技术最佳反应体系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL,Primer F/R各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 1 μL。反应条件为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,61 ℃ 30 s,扩增30个循环。通过绘制标准曲线发现,在109~104 copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性。该方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性强,对5种病原菌的最低检测限分别为40、20、200、500和20 CFU/mL,显示出较高的灵敏度,且样品平均检测时间缩短至26 min左右。本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础。     

养殖大菱鲆蟹栖异阿脑虫病及其防治研究

对目前我国大菱鲆养殖过程中普遍发生的一种重要疾病———盾纤毛虫病的防治进行了较为全面地研究。描述了流行病学特征、病原形态学特点及分类地位,进行了主要环境因子对病原纤毛虫生存、生长的影响以及药物对纤毛虫的体外杀灭实验,并对实验室筛选的高效、低毒药物进行了临床治疗实验。研究结果表明,大菱鲆盾纤毛虫病的病原为蟹栖异阿脑虫(MesanophryscarciniGroliere&Leglise1977),属于广温、广盐、偏酸性食腐种类。多种药物对虫体的杀灭实验表明,甲醛、双氧水和复方中草药‘盾纤虫清’对该虫有较好杀除效果。甲醛溶液在3·1×10-5浓度下,7h可以杀死盾纤虫,双氧水在6·2×10-5浓度下,30min可杀灭虫体。另外,口服中草药‘盾纤虫清’(5g/kg饵料的添加量)显示出良好的治疗效果,为实际生产中防治盾纤虫病提供了理论依据。     

我国养殖大菱鲆病毒性红体病及其流行情况调查

大菱鲆病毒性红体病(Viral reddish body syndrome,VRBS)是一种新发现的感染我国养殖大菱鲆的流行性疾病。本文描述了病鱼的外观症状和解剖病理特征,报道了该病的病原及疾病流行情况调查结果。外观检查发现,病鱼的体表无明显损伤,但腹面沿脊椎骨附近皮下淤血、发红,鳍及鳍基部充血、发红;病鱼贫血,血液凝固性差;肾脏肿大,呈灰白色。组织病理学研究显示病鱼脾组织中存在大量肥大细胞,电镜切片中可见大量平均直径约125nm的二十面体病毒粒子,即大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)。将过滤除菌的含TRBIV的病鱼脾组织匀浆液,经腹腔注射进行人工感染,感染鱼在3周内的累积死亡率达85．7％,死亡大菱鲆表现出腹面和鳍边发红等外观症状,并在感染鱼脾组织切片中观察到大量同样的病毒粒子,由此证实TRBIV是我国养殖大菱鲆病毒性红体病的病原。疾病流行情况调查显示,该病多在养成期大菱鲆中流行,高发季节为每年的8～12月。     

益生菌的研究现状及其在海水养殖中的应用

随着水产养殖业的发展,疾病问题越来越受到人们的关注,利用益生菌生态防治更是被人们所重视。本文对有关益生菌在国内外的研究进展做一简要综述,并对它在改善养殖环境、防治疾病等方面的作用进行了深入探讨;同时也指出了它在应用方面存在的问题及今后主要发展方向。     

双氧水和甲醛在海水中的消解速率及其对水质因子的影响

采用显色法分别检测分析了甲醛、双氧水在海水中的消解速率,其最低检出限分别为0.25 mL/m<'3>和0.125 mL/m<'3>;同时研究了两种消毒剂加入海水中对水质因子的影响.结果表明:这两种消毒剂的消解速率与其使用浓度密切相关,使用浓度越高,在海水中的消解时间越长.甲醛浓度在100 mL/m<'3>时,48 h显示白浊,基本上降解消除;而当双氧水浓度在100 mL/m<'3>时,96 h仍有较高残留.由此得出,相同浓度甲醛的消解速率比双氧水快得多.在1 500 mL/m<'3>双氧水和600 mL/m<'3>甲醛极高浓度下,7 d后仍保持着很高的残留量.海水中加入甲醛,溶解氧、盐度、温度、pH均没有显著变化(P>0.05),而加入双氧水的海水,除了溶解氧提高以外(P<0.05),其它水质因子没有显著变化(P>0.05).建议在使用甲醛、双氧水时,应尽量避免使用高浓度剂量.同时应根据不同浓度双氧水、甲醛的药效作用和降解时间决定废水排放时间.也可敷设缓冲排放池,使消毒剂在海水中充分降解,防止过多的化学残留直接排放入海,破坏水域生态环境.这为正确使用双氧水和甲醛提供了理论依据和参考.     

养殖大菱鲆隐核虫病及其治疗

根据流行病学特征、病原形态、病理分析,确定了感染大菱鲆的寄生虫为刺激隐核虫,并进行了几种常用药物及自主研发复方中草药“HD-2”对刺激隐核虫的离体杀灭试验和临床治疗观察。结果表明,双氧水(H₂O₂)和复方中草药“HD-2”对该病有良好的杀灭和治疗效果。使用复方中草药“HD-2”,同时结合100～200 mL/m³的双氧水药浴,可达到迅速控制病情、病症消失的良好治愈效果。本项研究率先提出了复方中草药和双氧水可替代甲醛治疗隐核虫病的治疗方法,具有高效、低毒、低残留之优点,为有效防治隐核虫病提供了理论依据和技术支撑,对防止滥用化学药物、提高水产品质量和保护生态环境具有重要的现实意义。     

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上,筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测,并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示,13个位点中有3个单态性位点,其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)～0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)～0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(H_o)介于0.031(SNP113)～0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)～0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离HardyWeinberg平衡。QTL验证结果表明,SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型,发现二倍型K_1(CC AA TT)抗病力最强,S_1(CC AA)、S_3(CC AC)在生长方面优势显著,相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

养殖刺参早期发育阶段体内可培养细菌的菌群特征及其与环境菌群相关性分析

采用传统细菌培养方法，对养殖刺参(Apostichopus japonicus)早期发育各阶段幼体体内及环境(投入饵料及培育用水)菌群的组成与结构展开研究，对分离的优势细菌进行分子鉴定，在此基础上，进行了刺参幼体体内菌群结构与环境菌群结构相关性分析。幼体各发育期的细菌培养结果显示，在幼体开口前的各发育时期(性腺、卵、受精卵、原肠胚)均无可培养细菌，在投饵以后，耳状幼体、樽形幼体体内可分离到可培养细菌，幼体发育到稚参以后，消化道可培养细菌总数急剧增加，并在4月龄时达到108 CFU/g数量级。在幼体体内可培养细菌中，弧菌(Vibrio)占比为2.2%~77.3%。对环境菌群的细菌培养结果显示，培育用水中细菌含量变化不显著，随着幼体发育期饵料的转变，不同时期饵料中细菌含量差异显著。整个养殖系统中共分离到65株优势细菌，16S rDNA鉴定结果显示，所分离的65株优势菌鉴定为14个属43种细菌。相关性分析结果显示，随着幼体的发育，生物饵料中的细菌对消化道中的菌群结构影响越来越大。本研究结果为解析刺参消化道菌群的形成过程和演替规律以及养殖用益生菌的筛选与应用奠定了基础。     

黄连素对海水病原菌的杀灭效果及药效稳定性

为探讨黄连素对主要海水养殖病原菌的抑菌作用,采用二倍稀释法测定黄连素对迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌等10种病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度,并以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种为指示菌,研究黄连素在不同温度、存储条件和金属离子影响下的药效稳定性。试验结果显示,黄连素对10种海水养殖病原菌均具有较好的抑菌及杀菌作用,最小抑菌质量浓度为64～256mg/L,最小杀菌质量浓度为256～1024mg/L。其中,黄连素对大菱鲆弧菌和溶藻弧菌抑菌作用最明显,最小抑菌质量浓度为64mg/L;对鳗弧菌、大菱鲆弧菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鲨鱼弧菌和轮虫弧菌杀菌作用最强,最小杀菌质量浓度为256mg/L。质量浓度为512mg/L的黄连素溶液分别在20、40、60、80、100、121℃处理下作用30min,对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的杀菌率均超过99%,将20、60、100℃处理的黄连素溶液于室温下避光存储35d,对指示菌的杀菌率依然大于99%,显示其良好的药物稳定性。金属离子的影响试验也证实,水环境中的Na+、Mg~(2+)、Ca~(2+)、K~+等离子对黄连素的杀菌效果无显著影响。因此,黄连素适宜作为防治水产动物细菌性疾病的临床药物。