病毒快克对人工诱发鸡法氏囊病的疗效观察

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一种急性、接触性传染病.该病发病率高,传播快,给养鸡业带来极大危害.为寻求一种有效治疗药物,笔者对病毒快克治疗人工诱发IBD效果进行了观察,现报告如下.     

新疆美利双羊对绵羊慢病毒的抗体应答的转换

用琼扩（ＡＧＩＤ）试验每月１次检查绵羊慢病毒（ＯｃＬＶ）北疆株（ＮＸＪｓｔｒａｉｎ）血清学阳性羊的抗体应答的转换。２头受试公羊和８头母羊分别连续检查６个月和１３～１５个月。１０头受试羊中有７头的对病毒核心蛋白（ｐ２６）的抗体（外线）与对病毒包膜糖蛋白（ｇｐ１３５）的抗体（内线）以及与同时对ｐ２６和ｇｐ１３５二者的抗体（双线）发生转换。３０％～５０％的受试羊在一次性琼扩试验检查时只出现外线,３头血清学可疑羊在２～３月后全部血清学转阳。作者等还对抗体应答转换的原因和琼扩试剂的合格性进行了讨论。     

犬瘟热重组N蛋白抗原间接ELISA方法的建立及应用

本研究以纯化的犬瘟热病毒（CDV）重组N蛋白为诊断抗原,建立了犬瘟热病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法,将其命名为rN-CDVELISA。确定最佳抗原包被量为0．167μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1：100,其作用时间为45min,羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1：2000,作用时间为60min,S／P值≥0．208者判为阳性,S／P值≤0．16者判为阴性,介于两者之间者判为可疑。该抗原不与犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬副粘病毒、犬波特氏杆菌等4种疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内、批间重复试验,变异系数均小于15％,具有良好的重复性;检测血清样品96份,与进口诊断试剂盒的符合率为97．1％。本研究为现地免疫犬群抗体检测和进行CDV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒(AIV)NA基因，克隆入pMD18-T载体中，再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9k中，构建了重组转移载体pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GSll5和筛选高拷贝重组转化子及筛选His^ Mut^ 表型转化子后，摇瓶培养，10mL／L甲醇诱导表达后，经SDS-PAGE、Western-blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明，获得了几株高效表达重组表达株，并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

鸭维甲酸诱导蛋白Ⅰ基因原核表达和单克隆抗体的制备及鉴定

本试验旨在制备针对鸭维甲酸诱导蛋白Ⅰ（RIG-Ⅰ）全长蛋白的单克隆抗体。从鸭脾脏cDNA中扩增鸭RIG-Ⅰ基因N端长度均为900 bp的a（1-900 bp）和b（751-1650 bp）2段基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-30a中;重组质粒转化BL21感受态细胞后,经IPTG诱导表达,将获得的目的蛋白免疫BALB/c小鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,并进行间接ELISA检测。结果显示,筛选出17株与分段表达的鸭RIG-Ⅰ蛋白有良好反应性的杂交瘤细胞株,测定单克隆抗体上清效价均为1：512;间接免疫荧光（IFA）与Western blotting分析结果显示,10H7C3和2A10A2 2株单克隆抗体与原核表达的鸭RIG-Ⅰ全长蛋白有良好的反应性。本研究制备了特异性鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体,为进一步研究RIG-Ⅰ基因的功能奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒感染海兰白鸡模型的建立

为建立H5N1亚型禽流感病毒感染海兰白鸡模型,本研究选取1株鹅源H5N1高致病性禽流感病毒A/goose/guangdong/1/96(H5N1)(简称GD1/96),测定其对4周龄海兰白鸡的半数致死量.感染模型试验中,将30只4周龄海兰白鸡随机分成3组,每组10只,5只直接感染,5只同居,试验组设置一个重复,将病毒液稀释至10^4.5EID₅₀,滴鼻、点眼各0.1 mL,对照组接种PBS,感染后24 h放入同居鸡;感染后连续观察14 d,记录死亡时间,每天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子;感染组和同居组第3、5 天各剖解3只鸡,采集气管、肺脏、脑、脾脏、肾脏和十二指肠,进行病毒分离;qRT-PCR法分析感染组和同居组第3、5 天鸡肺组织中IFN-α和TNF-α的相对表达量.结果显示,GD1/96株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.167/0.1 mL,对4周龄海兰白鸡的半数致死量为10^4.5 EID₅₀.感染模型试验结果显示,以10^4.5EID₅₀的攻毒剂量感染海兰白鸡,感染组鸡在感染后8 d全部死亡;在感染和同居3 d后,各组鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子均可检测到病毒;感染和同居后第3、5 天,各组鸡的6种组织中均可分离到高滴度的病毒;IFN-α和TNF-α在感染组和同居组的鸡肺脏组织中的表达量均显著增加(P <0.05).本试验建立了海兰白鸡的H5N1亚型禽流感病毒感染模型,为H5N1亚型禽流感病毒的致病机理及表达抗流感基因转基因鸡的研究奠定了基础.     

靶向Pol基因siRNA抑制J亚型禽白血病病毒复制的研究

为筛选能够有效抑制J亚型禽白血病病毒(ALV-J)复制的siRNA,本研究根据ALV的pol基因保守序列设计合成5对shRNA序列,并将其分别克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建siRNA表达重组质粒,分别为pcDNA-sh-po1711、pcDNA-sh-po1814、pcDNA-sh-po11016、pcDNA-sh-po11915和pcDNA-sh-po12516.将重组质粒分别转染DF-1细胞6 h后,以100TCID50的ALV-J感染细胞,并利用IFA、western blot和real-timePCR方法评价其对ALV-J复制的抑制效果.IFA和western blot检测结果表明:其中pcDNA-sh-po1711、pcDNA-sh-po1814和pcDNA-sh-po12516可以有效抑制病毒囊膜蛋白的表达.Real-time PCR结果显示:与阴性对照和空载体对照相比,这3种siRNA在mRNA水平对ALV-J的抑制率达29%～86%.本研究在细胞水平上筛选的siRNAs可作为候选siRNAs,为抗鸡ALV-J的研究奠定基础.     

鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法的建立及应用

本研究以鸭病毒性肠炎(DVE)病毒作为包被抗原,建立了检测DVE抗体的间接ELISA诊断方法.应用该ELISA诊断方法检测DVE阳性对照血清,当血清稀释至12800 倍时,结果仍为阳性;检测其它7种鸭病阳性血清结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于10%;该检测方法与血清中和试验的符合率为100%.DVE 活疫苗皮下免疫鸭抗体监测结果表明:鸭免疫后第7d 可以在血清中检测出DVE特异性抗体.本试验建立的诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DVE免疫鸭的抗体监测和DVE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因vpl的原核表达及其抗原性分析

通过RT-PCR方法克隆出DHV-1:161/79/V结构蛋白vpl基因片段,将其克隆到pUD18-T载体中,测序结果为714 bp.vp1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+),获得重组质粒pET-VP1,转入E.coil Rosetta-gami(DE3)pLysS,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明在大肠杆菌中表达了1个相对分子量约为47 ku的融合蛋白(Trx-His-VP1),将此融合蛋白用His-Ni+亲和层析法进行纯化.Western blot分析表明,Trx-His-VP1能与DHV-1阳性血清发生特异性反应,说明表达的结构蛋白VP1具有良好的抗原性.     

禽流感H5亚型基因工程亚单位疫苗对哺乳动物的免疫保护

该研究以本课题组克隆构建并于昆虫/杆状病毒表达系统中表达的禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)H5HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIVH5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100%的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡。