大肠杆菌F18菌毛FedE蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18菌毛E亚单位的基因序列(fedE)设计1对引物,利用PCR技术从重组质粒TFl07E中扩增到一段序列,并按预定的阅读框架插入到表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedE,并转化大肠杆菌BL21获得重组菌PPFedE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明：该序列大小为459bp,与GENEBANK中的FedE结构编码序列(Z26520)完全一致。通过对菌体裂解物的SDS—PAGE电泳分析以及Western blotting鉴定,证明重组大肠杆菌PPFedE的可以表达融合蛋白形式的FedE(命名为GST-FedE),即FedE蛋白(16．297ku)与谷胱苷肽转移酶(27．335ku)相连组成分子量为43．632ku的融合蛋白。     

羊消化道线虫病的诊断与防控

<正>羊消化道线虫病可导致肉羊消瘦或贫血,影响羊只正常发育,并可造成死亡。寄生于羊消化道的线虫种类较多,主要有食道口线虫、仰口线虫、毛尾线虫和细颈线虫。一、病原特征1.食道口线虫也称为结节虫,寄生在羊的大肠。羊感染后,肠壁上出现大量呈米粒到蚕豆粒大小不等的结节;结节里面存在虫体,并继续生长发育为成虫。     

牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化

根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组...     

仔猪水肿病的PCR快速诊断

根据GenBank发表的志贺毒素2型变异体(shiga-toxin 2e,Stx2e)的基因序列设计1对特异性引物,建立了一种检测STEC的PCR方法.通过对已知毒素类型参考菌株的扩增,证明所建立的PCR方法能够特异鉴定STEC.采集临床疑似仔猪水肿病未死亡病例(5例)的直肠棉拭子样品和死亡病例(15例)的十二指肠病料,接种LB内汤于37℃增菌培养4～6 h后,运用所建立的PCR方法对增菌培养物进行快速检测,结果表明有19例为STEC感染.通过与细菌分离后再鉴定的比较,证明了该诊断方法具有的速度快、检出率高的特点,尤其适合于临床活体检测.     

致猪水肿病大肠杆菌减毒株抑制其野生菌株黏附的研究

在已构建的产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)减毒菌株F2(O139∶F18)的基础上,进一步研究其体外对野生菌株S451521的黏附抑制作用。无菌采集断奶后1周仔猪的十二指肠,并分成若干肠段(每段2cm)试验组。将肠段分别与不同比例的减毒菌株和野生型菌株吸附后,每组取相同面积肠段并置于相同体积的LB肉汤中;充分刮取肠黏膜制成混悬液后,倍比稀释并分别涂布于LB平板上培养后细菌计数;分别挑取各组平板上的单菌落120个,通过细菌分类鉴定判定减毒菌株F2对其野生菌株的黏附抑制情况。结果表明:F2株细菌能明显抑制其野生菌对仔猪上皮细胞的黏附,抑制率在84.62%以上。该结果提示减毒菌株F2作为微生态制剂的可能性,对预防仔猪水肿病具有潜在的研究价值。     

复方糖苷抗新城疫病毒感染作用

采用2种方法研究了复方糖苷抗新城疫病毒(Newcastle disease Virus,NDV)感染作用。一是鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)培养法,通过观察NDV CPE的形成及测定CEF OD值的变化,计算病毒抑制率等指标,综合评价复方糖苷在细胞水平上抗NDV作用,并从直接灭活病毒、阻断病毒吸附与生物合成及释放等环节,探讨了复方糖苷的抗NDV途径。二是将复方糖苷稀释成1 200,1 000,800,600,300μg/m L 5种浓度与100 EID50 NDV液混合后接种9日龄SPF鸡胚,于72 h后统计鸡胚的存活数并测定尿囊液血凝效价(HA),依此判定复方糖苷在鸡胚内抗NDV作用。结果表明:随着药物浓度的增加CPE的特征逐渐减弱,OD值明显升高,病毒抑制率增大,当复方糖苷质量浓度为600μg/m L时对NDV具有显著的直接杀灭与阻断吸附作用。HA在1 200,1 000μg/m L时均为0。表明复方糖苷具有显著的抗NDV感染作用。     

断奶仔猪源大肠杆菌F18菌毛的分子流行病学研究

利用F18菌毛a因子单克降抗体以及已建立的鉴定F18菌毛及其亚型的双重PCR法,对来自断奶仔猪水肿病和／或腹泻病例的60株VTEC、24株VTEC／ETEC以及24株ETEC的进行了F18菌毛检测,以了解F18ab^＋和F18ac^＋大肠杆菌在江苏省断奶仔猪群的分子流行病学。结果表明：通过F18菌毛a因子单克隆抗体,可检测出52株大肠杆菌为F18^＋,检出率为48．15％;而通过双重PCIL方法,共检测出63株大肠杆菌为F18^＋,检出率为58．33％,其中53株（49．07％）为F18ab^＋10株（92．6％）为F18ac^＋。另外还发现：在VTEC、VTEC／ETEC以及ETEC的菌株之间,这2种F18菌毛亚型的分子流行病学是不同的。在VTEC中,F18ab^＋,菌株37株（61．67％）,未发现F18ac^＋菌株;在VTEC／ETEC中,F18ab^＋菌株15株（62．50%）,F18ac^＋菌株8株（33．33％）;而在ETEC中F18ab^＋菌株只有1株（4．17％）,F18ac^＋菌株只有2株（8.33％）。以上数据表明：④PCR法检测F18菌毛优于单抗法;②F18菌毛是VTEC／ETEC、VTEC的重要致病因子,而在ETEC中则明显低于VTEC／ETEC和VTEC;⑧F18ab^＋菌株一般为SLT-IIe^＋,而F8ac^＋菌株一般为STI^＋。     

大肠杆菌F18菌毛E亚单位基因克隆与序列分析

根据已发表的F18ab菌毛E亚单位的基因序列(fedE／ab)，设计1对引物，利用PCR技术从10株大肠杆菌(F107／86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到1个片段，并克隆至pGEM-T载体，获得重组质粒TF107E、TYCED1E、TYCED2E、TCE、TDE、TEE、T12FE、T8813E、T8199E、T2134PE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明，这10个片段大小均为516bp。通过与已发表的fedE／ab序列进行比较，发现这10个菌株的fedE序列高度同源，其中F107／86、YCED2、C、D、E、8813、8199、2134P的fedE序列完全相同，只有YCED1株在第45位碱基处存在1个G—A转换、12F株在第316位碱基处存在1个G—A转换。这说明F18ab和F18ac菌毛的fedE基因相同，fedE是F18菌毛的保守性亚单位。     

猪三十九肽胆囊收缩素(CCK39)基因的克隆和表达

以猪十二指肠中提取的总RNA为模板，根据GenBank已发表的猪三十九肽胆囊收缩素（CCK39）基因序列设计1对特异性引物。用RT-PCR扩增CCK39基因的cDNA，纯化后克隆人pUC18载体，BamHⅠ／EcoRⅠ双酶切后插入pGEX-6P-1质粒获得原核表达载体。0．5mmol／L IPTG诱导表达并纯化产物，以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备单因子血清；用抗GST抗体和自制的抗CCK39的单因子血清Westen blot检测融合蛋白。结果表明：成功地克隆出CCK39基因的cDNA，构建的原核表达载体pGEX-CCK39成功地表达约32kD的融合蛋白，抗GST抗体和抗CCK39单因子血清能识别融合蛋白，证明获得的融合蛋白具有较好的抗原性，为制备抗CCK抗体及研究CCK的各种生理功能提供大量、低廉和抗原性较强的胆囊收缩素。