不同毒力番鸭呼肠孤病毒在番鸭免疫器官的分布和排毒

探讨番鸭呼肠孤病毒强毒株和弱毒株在番鸭免疫器官中的分布和排毒的差异。结果显示强毒株在感染后1d就可在脾脏、法氏囊、胸腺检出病毒RNA,高峰期为攻毒后7～14d;直到感染后35d,在免疫器官中不能检测到病毒RNA。接种强毒株后7d开始向外界排毒,而14d后停止向外界排毒。雏鸭免疫弱毒疫苗后3d,即可在脾、胸腺、法氏囊中检出病毒RNA;高峰期为攻毒后7～14d,免疫后21d免疫器官中的检测逐渐降低,直到感染后28d,在免疫器官中不能检测到病毒RNA。表明番鸭接种活疫苗后7d开始向外界排毒,而11d后停止向外界排毒。     

禽新型黄病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于禽新型黄病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。根据禽新型黄病毒E蛋白基因序列,在保守区设计了一套针对禽新型黄病毒基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果表明该方法对NDRV、GPV、MDRV、NDV、ILTV、FPV均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,45min内可完成反应;该方法对禽新型黄病毒RNA的最小检测限为1pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的100倍。本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行禽新型黄病毒的快速检测。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEV N基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1 168 bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株序列的同源性为95%～97%;敏感性测定结果为可扩增到18 pg的TGEV N基因cDNA.结果表明,建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查.     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的番鸭呼肠孤病毒（DRV）δC蛋白基因的核苷酸序列设计引物，应用RT-PCR技术，扩增番鸭呼肠孤病毒δC蛋白基因，经T／A克隆，插入到pMD18-T载体上，测序分析结果表明MW9710株δC蛋白基因的开放阅读框为810nt，编码由269个氨基酸组成，分子量为29．4Ku的δC蛋白，应用BLAST等分子生物学软件分析，其与法国DRV89330株的δC蛋白基因的同源率达93％，所推导的氨基酸的同源率达93％，与ARV的核苷酸无同源性，推倒的氨基酸的最大同源率为26％。经Antheprot 5．0蛋白质软件分析表明：MW9710株δC蛋白具有较大的疏水性和抗原性，无跨膜区，为进一步研究该基因的表达和研制基因工程疫苗及诊断试剂奠定基础。     

番鸭呼肠孤病毒弱毒株在免疫番鸭体内的分布及排毒规律

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)B37弱毒株经肌内免疫1日龄雏鸭,应用RT-PCR检测病毒核酸,以阐明病毒在体内分布及排毒规律。结果表明,B37株免疫雏鸭后4h,即可在血液、心、肝、脾组织中检出DRV RNA;接种后8h,血液、心、肝、脾、肺、肾、胰腺均可检测到DRV RNA;接种后3d,喉头和泄殖腔棉拭子可检出DRV RNA;接种后14d,喉头和泄殖腔棉拭子已不能检出DRV RNA;接种后28d,肺、肾和胰腺均已不能检出DRV RNA;接种后42d,血和心脏已不能检出DRV RNA;接种后49d,所有组织均已不能检出DRV RNA。因此,DRV弱毒在血液、心脏中分布时间为接种后4h～35d,在肝、脾组织中分布时间为4h～42d;肺、肾和胰腺的分布时间为8h～25d;向外界排毒时间为3～14d。     

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒

参考 Gen Bank中番鸭呼肠孤病毒 (m uscovy duck reovirus,MDRV ) S1基因序列 ,用计算机设计并合成了 1对引物 HP11、HP12 ,以此引物用 RT- PCR对番鸭呼肠孤病毒 S1基因进行了特异性扩增。结果表明 :引物 HP11、HP12能从所有供试的 4株分离毒 MDRV- MW9710、MW980 6、MW980 9、MW9810扩增出 30 0 bp S1基因 c DNA片段 ,而不能从禽呼肠孤病毒 (ARV) S1133株和番鸭胚成纤维 (MDEF)细胞培养物中扩增出任何片段 ;该 RT- PCR的检测灵敏度为 1pg的病毒核酸 ,特异性强 ,重复性好 ,对含毒细胞培养液和尿囊液只需用氯仿进行简单处理 ,即能检测出 MDRV核酸。因此认为 ,该 RT- PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒的快速检测     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。     

新型鸭呼肠孤病毒病浓缩灭活疫苗的制备及免疫原性分析

为研制高效的新型鸭呼肠孤病毒病(NDRV)灭活疫苗,分别采用病毒尿囊液和浓缩后病毒尿囊液为抗原,经甲醛灭活处理后与常规油佐剂制成灭活疫苗,并进行种鸭免疫后血清学检测、雏鸭免疫保护及安全试验。结果表明,浓缩疫苗安全性好,能明显提高疫苗的免疫效果,高峰期抗体效价的免疫持续期比常规疫苗长;浓缩疫苗免疫雏鸭后的免疫保护性达100%。以上研究表明,NDRV浓缩疫苗安全、高效,在雏鸭上具有良好的免疫保护效果,具有良好的市场前景。     

TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达

运用DNA重组技术将猪传染性胃肠炎病毒核衣壳基因、猪流行性腹泻病毒核衣壳基因编码最大局部亲水性抗原决定簇基因片段进行串联,克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建预防仔猪冠状病毒性腹泻双价基因原核表达质粒.将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,双价重组基因表达...     

猪传染性胃肠炎病毒福建株M基因的克隆与生物信息学分析

对猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)福建分离株(TGEV-FJ 株)M基因进行克隆、测序,并利用生物信息学技术分析TGEV-FJ株M蛋白基因的同源性、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点及其二级结构.结果显示,成功扩增出M基因完整目的片段(7...