应用液态悬浮芯片技术建立17种大肠杆菌耐药基因多重快速检测方法

为建立一种快速、高通量的多重耐药基因检测方法,利用Luminex液态芯片平台,建立了可同时检测17种耐药基因的液态芯片检测方法。该方法对大肠杆菌常见的七大类抗菌药物所对应的17种耐药基因（blaSHV、blaCMY-1、Aph3-IIa-1、aac(6)-Ib-cr、aadA-1、cmlA-1、gyrA、mcr-1、NDM-1、parC、qnrS-1、sul-1、sul-2、sul-3、tetA、tetB、tetX）进行序列分析,随后依次对其设计多重PCR特异性引物,构建特异的阳性质粒作为阳性参比品进行液态芯片检测条件优化,从而进行多重耐药基因液态芯片检测方法的研发。结果显示：成功构建了17种耐药基因的阳性质粒,并建立了两套体系用于检测17种耐药基因。在特异性试验中,两套体系中的检测信号无干扰,具有较高的特异性数值;敏感性试验中,体系一的单一质粒最低检测量为102~104 copies/μL,混合质粒为103~105 copies/μL;体系二的单一质粒最低检测量为102~105 copies/μL,混合质粒为104~106 copies/μL;有效性试验中,液态芯片法与PCR检测结果的Kappa值多在0.60以上,具有高度一致性。结果表明,本研究建立的2套液态芯片检测体系具有高通量、高灵敏和高特异性的优点,可同时对17种耐药基因进行检测,能够达到快速检测的目的。     

不同枣粉水平对陕北白绒山羊肉呈味物质的影响

本试验旨在研究不同枣粉水平对陕北白绒山羊肉呈味物质的影响。选取40只6月龄、初始体重为(20.15±1.63)kg的健康陕北白绒山羊,随机分为5组(每组8个重复,每个重复1只羊),分别饲喂含0(对照组)、10%(试验Ⅰ组)、15%(试验Ⅱ组)、20%(试验Ⅲ组)、25%(试验Ⅳ组)枣粉的试验饲粮。预试期10 d,正试期70 d。结果显示:1)试验Ⅲ组的鲜味值显著高于对照组及试验Ⅱ和Ⅳ组(P<0.05),咸味值显著高于对照组(P<0.05)。2)试验Ⅲ组的天冬氨酸(Asp)和丙氨酸(Ala)含量显著高于对照组(P<0.05),谷氨酸(Glu)含量显著高于对照组及试验Ⅰ和Ⅱ组(P<0.05)。3)随着枣粉水平的提高,肌苷酸(IMP)、肌苷(INO)和次黄嘌呤(HYP)含量逐渐增加,一磷酸腺苷(AMP)含量先增加后降低,试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的IMP含量显著高于对照组和试验Ⅰ组(P<0.05),试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的INO、HYP和AMP含量显著高于对照组(P<0.05)。由此得出,枣粉能促进氨基酸和呈味核苷酸在陕北白绒山羊肉中的积累,饲粮中枣粉水平为20%时,羊肉中呈鲜味的游离氨基酸和核苷酸含量较高,滋味最好。     

1990—2019年阿拉尔垦区植被覆盖时空变化特征分析

监测植被覆盖变化对区域生态环境评价和可持续发展具有重要意义。本文基于Landsat遥感影像和相关统计数据,运用像元二分模型和重心转移模型等方法分析阿拉尔垦区1990—2019年近30年的植被覆盖时空变化特征。结果表明：1990—2019年,阿拉尔垦区平均植被覆盖面积呈增加趋势,高和极高植被覆盖区的面积呈增加趋势,差异显著,分别增加了674 km²和1 147 km²;阿拉尔垦区植被覆盖变化存在时段性和区域性差异,时段上,2005—2010年垦区西北部开始出现植被,以中覆盖类型为主,区域上,垦区西北部植被覆盖的增加趋势最显著;近30年,垦区植被覆盖重心整体向东北方向转移;气候对阿拉尔垦区植被覆盖变化有一定的影响,但人类活动影响最直接。在未来发展中应注重保护自然植被,有计划地开垦土地,合理调整垦区农业结构,科学分配水权,保证垦区生态用水,实现可持续发展。     

青藏高原典型高寒荒漠生长季蒸散及水分消耗特征研究

为探究青藏高原典型高寒荒漠下垫面水分消耗规律,以2019年青藏高原典型高寒荒漠地区沱沱河站监测的涡动数据和微气象数据为基础,分析不同时间尺度蒸散值的变化特征和下垫面水分消耗特征,研究结果表明：小时平均蒸散发量最大值出现在14—15时,达0.46 mm·h^-1;日蒸散值最大值出现在7月7日,为8.58 mm·d^-1,最小值出现在4月2日,为0.30 mm·d^-1;整个生长季蒸散值呈先增加后减小趋势,其中7月份最大,为120.68 mm,4月份最小,为64.80 mm;生长季总蒸散发量为581.15 mm,平均每天蒸散4.01 mm。整个生长季累计降水量为235.70 mm,蒸散发量与降水量（Precipitation,Pr）的差值（The difference between ET and Precipitation,IETP）显示,2019年青藏高原典型高寒荒漠植被生长季（4—8月）水汽交换以下垫面水分消耗为主。     

花椒叶浸提液对紫云英种子的化感作用

研究了不同浓度(5,10,20,40 g/L)的花椒叶浸提液对供试植物紫云英的种子萌发、幼苗根长及生理生化的影响,探究花椒化感作用的可能机理,从而为全面了解花椒林草间作种间关系及为农林复合经营和科学栽培提供理论依据.结果表明:1)花椒叶浸提液对紫云英种子萌发和幼苗根长均具有不同程度的抑制作用,且作用强度与浓度呈正相关(P<0.05);2)随浸提液浓度升高,紫云英幼苗体内超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著降低,过氧化氢酶(CAT)活性和超氧阴离子自由基(O2-)含量表现为先降后升,丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性糖含量则显著升高,而苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性则表现为先升后降.综上,花椒叶浸提液主要通过抑制紫云英体内防御酶活性,并产生对其细胞结构和功能伤害而发挥其化感效应.     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌感染小鼠脾脏转录组分析

试验旨在探索羊源D型多杀性巴氏杆菌入侵宿主脾脏组织中引发的免疫应答途径。首先利用羊源D型多杀性巴氏杆菌(HN01菌株)感染小鼠,建立羊源D型多杀性巴氏杆菌感染的动物模型;之后利用转录组测序技术获得感染小鼠与正常小鼠的脾脏转录组数据,并使用COG、KOG、eggNOG、GO、KEGG数据库对测序结果中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行功能注释与分析,同时对于显著富集到关键免疫通路的差异表达基因使用STRING软件和KEGG mapper进行蛋白互作分析,筛选出核心通路中起关键作用的基因;最后选取关键的10个基因进行实时荧光定量RT-PCR验证。转录组分析结果显示,与正常组相比,感染组中筛选出3 380个差异表达基因(P<0.01,log₂|FoldChange|≥0.5),其中1 691个基因上调,1 689个下调。基因功能富集分析结果表明,感染组脾脏中的差异表达基因主要发挥信号转导的功能,其主要参与的生物途径包括细胞因子与细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路。蛋白互作分析筛选出约28个核心差异表达基因,结合实时荧光定量RT-PCR验证后,其中9个基因的表达结果与测序一致,分别是C3、Cd4、Cxcl13、Lck、Gnai1、Grap2、IL-6、Cxcr6及Serping1基因。本研究初步证明了脾脏在抵抗多杀性巴氏杆菌入侵中参与了一系列免疫应答反应,为进一步研究羊源D型多杀性巴氏杆菌与宿主之间相互作用的分子机制奠定理论基础。     

葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的影响

为探究葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的调控作用,在细胞诱导液中分别添加0、10、20、40、60和80 μmol/L葛根素进行成脂诱导分化,用油红O染色法和甘油三酯酶法检测脂肪细胞分化过程中脂滴聚集情况和甘油三酯含量以考察脂质沉积和分化效果,并确定葛根素的最佳添加浓度;用实时荧光定量PCR检测对照组(0 μmol/L)和最佳葛根素浓度添加组成脂标志基因细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)及成脂分化基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸结合蛋白(FABP4)、应激蛋白(TRIB)和叉头框蛋白O1 (FOXO1)的mRNA的表达水平,用Western blotting检测PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平。结果表明,与对照组相比,20、40和60 μmol/L葛根素均显著增加脂滴和甘油三酯含量(P<0.05),且40 μmol/L葛根素效果最佳;实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著上调成脂标志基因PPARγ、C/EBPα及成脂分化基因ACC、FABP4、FOXO1和TRIB的表达(P<0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著增加PPARγ蛋白表达(P<0.05)。综上所述,40 μmol/L葛根素能够促进松辽黑猪前体脂肪细胞的成脂分化和脂质沉积。