正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

南方、爪哇和花生根结线虫的快速灵敏的PCR鉴定方法

为了研制南方、爪哇和花生根结线虫快速灵敏的检测和鉴定方法，分别分离了4个南方根结线虫和3个爪哇根结线虫特异性的随机扩增多态性DNA(RAPD)片段。在这些RAPD标记DNA序列的基础上，设计了多对SCARPCR引物，并用源于国内外的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫群体验证其扩增特异性和灵敏度。最终确定了3对高效扩增的SCAR引物，     

RAPD技术对地方鸡种群体遗传结构的分析

利用ＲＡＰＤ技术对４个地方鸡种和１个引进鸡种的群体遗传结构进行分析，通过筛选的５个随机引物ＯＰＨ－０２、ＯＰＨ－０５、ＯＰＨ－１３、ＯＰＨ－１６、ＯＰＧ－０７对５个鸡种的池ＤＮＡ进行多态性研究，结果表明：５个引物共产生条带６１个，扩增产物片段的长度一般从１５０ｂｐ－４ｋｂ。     

不同引物对植原体的检测灵敏度比较研究

用常规PCR和巢式PCR对目前常用的各种植原体引物(fPl/rP7、fU5/rP7、fU5／rU3、fAY/rEY和fFD9/rFD9)的检测灵敏度进行了比较研究。研究发现，它们的检测灵敏度并不相同。最灵敏的引物(fAY/rEY)要比最不灵敏的引物(fFD9/rFD9)的灵敏度至少高出数千倍。因此，按照不同的检测目的选择所用的检测引物是明智的，特别是当待测样品中的植原体浓度极低时，比如葡萄组织样品中植原体的检测。据此提出了用于不同检测目的时的最佳引物。     

鸡大肠杆菌iss基因的克隆测序及原核表达

本实验对鸡大肠杆菌O2血清型菌株进行iss基因克隆测序，并在此基础上设计出两对套式引物，分别对含信号肽Miss基因序列和不含信号肽Miss基因序列进行扩增，并与原核表达载体pGEX-6p-1连接进行原核表达。iss基因克隆测序的结果与两组国外发表Miss基因序列进行比对，其同源性达100％。SDS—PAGE鉴定显示融合蛋白获得了较理想的表达，融合蛋白分子量分别约为36kD和33kD。     

猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

从确诊为猪附红细胞体感染的猪场，无菌采集血样，抽提猪附红细胞体基因组DNA，采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增，对扩增产物进行克隆和测序。从3个地理位置不同的猪场均成功地扩增出长度为1469bp的核苷酸序列。系统进化分析表明，3个猪场样品所测序列一致性达99．52％以上，具有相同的基因型，但与国外报道的猪附红细胞体Illinois株同源性为95％，属于同一基因群，但基因型不同；所有种类的附红细胞体和血巴尔通氏体组成同一进化分支，这类血营养菌与支原体科，支原体属的病原最靠近(75％)，而与立克次氏体目的病原较远(70％)。上述研究证实，广东所流行的猪附红细胞体是一种新基因型的猪附红细胞体，建议命名为猪附红细胞体广东株型；为反映进化关系，猪附红细胞体和其它血营养菌应划归于支原体科的支原体属。     

毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因在大肠杆菌的表达

根据克隆的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因(EnMIC-2(Gd))的cDNA序列设计特异性引物，用PCR方法扩增其阅读框架(ORF)后，克隆至质粒表达载体pET-32a( )，成功构建了重组表达质粒pET-32a( )-EnMIC-2。用CaCl2法将其转化至宿主细菌E.cliBL21(DE3)，并用IPTG成功诱导了EnMIC-2重组抗原在大肠杆菌表达。表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的10．8％，其相对分子质量约为55000。重组蛋白经SDS-AGE分析后，用E．necatrix(广东株)感染鸡的高免血清进行Western Blotting分析，结果为阳性。     

血清1、2、4、5型鸭疫里默氏杆菌的RAPD

以37℃摇震培养舜口烛缸厌氧培养，从12种培养基中选择出鸭疫里默氏杆茼的最优培养基和培养条件。以血清1、2、4、5型的鸭疫里默氏杆菌代表株A1、A2、A3、A4为研究对象，培养增殖后分别提取基因组DNA，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，对其基因组进行了DNA分析。从20条随机引物中筛选出8条随机引物，这8条引物对4种血清型的鸭疫里默氏杆菌的扩增图谱有较好的多态性，可作为分子标记鉴别4种不同血清型的鸭疫里默氏杆菌，同时还筛选出能在4个血清型的鸭疫里默氏杆菌代表株均出现相同的特征条带，而对照茼大肠杆菌、沙门氏茼无该条带的随机引物，从而为鸭疫里默氏杆菌病的分子诊断打下了一定基础。     

紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因的初步定位

以紫花苜蓿(Medicago sativa)不育系MS-GN-1A为母本,恢复系MS178为父本组合构建BSA分离群体,获得的F1代均表现为雄性可育,在大田种植了221株F2代群体单株,盛花期将花粉颗粒染色后,显微镜下观察统计出,不育的F2代株数为57,可育F2代株数164,并没有观察到半不育植株。将所有植株划分为可育和不育两组,并构建可育和不育DNA混池,混池DNA从可育和不育植株组DNA中各随机抽取20个样品,以此对恢复基因定位。随机挑选160对已知的四倍体苜蓿SSR引物扩增基因池DNA,获得2个具有多态性的分子标记,分别是Mt2c12、AW166,初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上的所有引物进行合成,进一步进行引物筛选,最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153,遗传距离分别为19.0、20.9、44.6和72.1cM。