紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因的初步定位

以紫花苜蓿(Medicago sativa)不育系MS-GN-1A为母本,恢复系MS178为父本组合构建BSA分离群体,获得的F1代均表现为雄性可育,在大田种植了221株F2代群体单株,盛花期将花粉颗粒染色后,显微镜下观察统计出,不育的F2代株数为57,可育F2代株数164,并没有观察到半不育植株。将所有植株划分为可育和不育两组,并构建可育和不育DNA混池,混池DNA从可育和不育植株组DNA中各随机抽取20个样品,以此对恢复基因定位。随机挑选160对已知的四倍体苜蓿SSR引物扩增基因池DNA,获得2个具有多态性的分子标记,分别是Mt2c12、AW166,初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上的所有引物进行合成,进一步进行引物筛选,最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153,遗传距离分别为19.0、20.9、44.6和72.1cM。     

牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针，摸索其最佳反应条件，进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性，最低检出限度为8.26×10¹拷贝/μL，在8.26×10³～8.26×10⁸拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系，同时不与其他致病菌发生交叉反应，组间及组内的变异系数均小于4%，应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品，与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。     

长链寡核苷酸生物合成方法的研究

化学合成长链寡核苷酸面临许多困难，研究通过对长链寡核苷酸生物合成方法的研究，成功合成并纯化了长链寡核苷酸，其长度达到146nt，并且其序列没有错误。生物合成的基本方法是：首先用一对PCR引物扩增DNA模板，     

天山樱桃EST-SSR引物开发及PCR反应体系优化

以新疆天山樱桃叶片为试材,从NCBI数据库中搜索天山樱桃EST序列,利用SSRHunter 1.3软件查找SSR位点,结合Primer 6.0设计引物,通过正交实验和单因素试验优化天山樱桃SSR-PCR反应体系,并用最佳体系对所开发的引物进行验证,以期为研究天山樱桃遗传多样性、构建遗传连锁图谱奠定基础。结果表明:从58对备选引物中随机挑选30对引物进行试验,有21对引物能够扩增出特异性条带,有效扩增率为70%。20μL天山樱桃SSR-PCR最佳反应体系为dNTP 0.2mmol·L~(-1)、引物0.4μmol·L~(-1)、Taq酶0.75U、模板DNA 60ng。     

应用SS-PCR技术建立番石榴实蝇快速鉴定方法

应用种特异引物PCR(Species-specific PCR, SS-PCR)技术,基于mt DNA COⅠ线粒体基因系列,设计了1对能够准确鉴定番石榴实蝇Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi)的种特异性引物FR447和FF463-486,选用番石榴实蝇作为阳性对照,以杨桃实蝇B.carambolae Drew&Hancock等其他19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。结果表明:仅番石榴实蝇能够在约645 bp位置扩增出1条清晰且单一的目的条带。将本实验建立的SS-PCR鉴定方法应用在实际检疫工作中,得到了验证。     

鹿流行性出血病病毒实时荧光PCR检测方法的初步建立

利用鹿流行性出血病（EHD）病毒核酸的保守靶序列（VP7）,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了EHDV荧光定量RT-PCR技术,并进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价。结果显示,该技术可有效检出EHD-1、EHD-2、EHD-4、EHD-7型病毒,与蓝舌病病毒（BTV）等病毒无交叉反应;对阳性模板（重组质粒）的检测灵敏度为1个copies;重复检测CV〈5%。因此,所建立的EHDV TaqMan/荧光定量RT-PCR方法可为鹿流行性出血病病毒检测提供一种快速、可靠的病原检测手段。     

大麻ISSR引物的筛选与细胞学制片技术的优化

在稳定的ISSR-PCR扩增条件下,使用50个大麻ISSR引物对代表性的大麻材料进行PCR扩增,筛选出14个适合大麻的ISSR引物;同时,为优化大麻染色体的制片质量,对大麻染色体制片过程中的变温预处理、低温提高中期分裂相的方法及解离等具体技术与方法进行了试验,优化后的大麻染色体制片条件为:芽长达1 cm后(21℃),23℃条件下促芽生长24 h,再低温(0℃)处理24 h,37℃解离20 min(20 g/L纤维素酶和20 g/L果胶酶)。适合大麻ISSR-PCR反应的引物筛选与染色体制片技术的优化,将为大麻遗传多样性的多层次化分析提供试验基础。     

基于介观量子理论的最佳PCR引物浓度计算

对PCR反应体系而言,引物浓度过高或过低对反应体系都存在严重的影响,只有合理的浓度区间才能对整个反应高效有序地进行发挥重要的作用.降低PCR引物间的量子效应有利于提高引物间PCR反应的独立性和确定性,故粒子自由程至少是相位关联长度的10倍,并由此可以得到引物反应浓度的上限;粒子非弹性散射的最大自由程是粒子运动的极限自由程,依此可以得到引物反应浓度的下限,从而确定了引物的有效浓度区间;引物浓度-扩增效率曲线一般呈单峰分布,利用黄金分割法可以精准、迅速地确定引物最佳浓度。基于上述计算方法,长20、25、30 nt的引物有效浓度区间分别为0.027~5.280、0.019~7.310、0.015~9.461 umol·L-1。引物有效浓度区间及最佳浓度对PCR反应体系的反应效率与速率、PCR产物质量等具有决定性的作用,而应用理论方法确定它们将对理论指导实验具有重要的意义。     

羊源性成分LAMP检测方法的建立

根据羊cyt B基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以LAMP荧光检测方法为基础,建立了检测羊源性成分的LAMP方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,比q PCR方法低10倍,达到5.928×10-3μg/μL;反应时间短,最快10 min即可完成反应。