观赏鸡中禽白血病病毒分离鉴定及全基因测序分析

为了解观赏禽元宝鸡中禽白血病病毒(ALV)的流行特点,通过接种DF-1细胞、ELISA和PCR检测,从元宝鸡中分离并鉴定出1株禽白血病病毒,命名为BJ1401。经PCR扩增、测序获得BJ1401的全基因序列。序列比对分析发现,病毒株BJ1401基因全长7 503 bp,其中,gp85基因核苷酸序列与C亚群同源性最高(91.6%),gp37、LTR与E亚群相应核苷酸序列同源性最高,分别为98.2%、91.6%。进化分析显示,gp85与C亚群代表株Prague C亲缘关系最近,gp37、LTR与E亚群代表株ev-1和SD0501处在同一进化分支上。表明观赏性元宝鸡中分离的禽白血病病毒BJ1401可能是C亚型与E型禽白血病病毒的重组病毒。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒(ALV)贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为:GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%～97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%～99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%～53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒（ALV）贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为：GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%~97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%~99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%~53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

K亚群禽白血病病毒5′LTR序列及启动活性分析

通过对ALV-K 5′LTR序列及其启动活性比较分析,以探究5′LTR对ALV-K体外复制能力的影响。选取广东某黄羽祖代种鸡场健康鸡群中分离到的ALV-K(GDFX0601)毒株作为研究对象,将其5′LTR核苷酸序列与国内外不同亚群ALV分离株比较分析,并将该ALV-K接种DF-1细胞,采用ELISA对细胞培养上清进行ALV p27抗原检测以分析其在DF-1细胞上的复制能力,还分别将ALV-K(GDFX0601)、ALV-J(CHN06)、ALV-E(ev-1)和ALV-K(JS11C1)5′LTR克隆进pGL3-Basic载体,分别转染DF-1、CEF和293T细胞后测定荧光素酶活性来评估不同毒株5′LTR的启动活性。结果显示,ALV-K(GDFX0601)与其他内源性ALV LTR相似性为98.5%,而与其他外源性ALV的相似性仅有70%左右,且其LTR U3区转录调节元件与外源性病毒差异较大,与内源性病毒相似。ALV-K(GDFX0601)在ALV易感细胞DF-1上的复制速度与感染能力均弱于外源性病毒ALV-A、ALV-B和ALV-J。5′LTR的启动活性试验发现ALV-K(GDFX0601)毒株LTR的启动活性比ALV-J和LTR为外源性的ALV-K(JS11CI)毒株的启动活性弱(P0.05)。ALV-K比其他亚群ALV复制能力低可能与5′LTR启动活性有关。     

内源和外源性禽白血病病毒鉴别PCR检测方法的建立

为建立简单快捷的内、外源性禽白血病病毒(ALV)的鉴别检测方法,本研究根据外源性ALVA亚群标准株RAV-1的p27、env基因以及内源性ALVE亚群标准株ev1的env基因的保守序列,设计3对特异性引物,可分别对ALV、外源性ALV(A、B亚群)和内源性ALV(E、J亚群)进行扩增,扩增产物分别为793bp、387bp和234bp,通过对各反应条件的优化建立了同时检测并鉴别内、外源性ALV的多重PCR方法。该方法特异性良好、灵敏度可达到2×103copies,利用该方法和ELISA对5份现地病鸡组织样品和10枚疑似感染内源性ALV的鸡胚进行检测,结果表明:4份病鸡样品均扩增出3条特异性片段;而9枚鸡胚仅扩增出793bp和234bp的特异性片段,2种检测方法的符合率为100%。该方法为内、外源性ALV的临床鉴别诊断奠定了基础。     

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...     

广西凭祥斗鸡禽白血病病毒检测及分离株env基因分析

为了解广西凭祥市特有家禽品种斗鸡禽白血病病毒(ALV)的感染情况,采集了该市3个鸡场斗鸡的肛拭子、血清、血浆样品共344份,用禽白血病ELISA检测试剂盒进行检测。结果显示,斗鸡ALV感染情况严重,其中肛拭样品ALV-p27抗原阳性率高达39.13%,血清样品病毒分离阳性率为12.97%,ALV-J和ALV-A/B抗体阳性率分别为22.39%和7.46%;对从2只斗鸡获得的病毒分离株DJ-3-18和DJ-45进行病毒囊膜蛋白基因env的扩增、序列测定及比较分析,结果显示2株病毒的gp85基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为88.2%~96.5%,gp37基因与ALV-A亚群参考株之间氨基酸的同源性为91.4%~98.0%,其中与台湾A亚群蛋鸡源分离株TW-3577的亲缘关系最近,而与ALV其他亚群毒株的同源性则较低。结果表明,首次获得的2株斗鸡源ALV分离株属A亚群。     

地方品种HR土鸡不同亚型禽白血病病毒的共感染

为研究HR土鸡中存在的不同亚型禽白血病病毒(ALV)共感染的情况,本实验分别采集46只HR土公鸡的泄殖腔棉拭子和455枚鸡蛋卵白样品,采用ELISA试剂盒检测p27抗原;并采用相应的ELISA试剂盒分别检测卵黄中J亚型ALV(ALV-J)和AB亚型ALV(ALV-AB)抗体。结果表明:HR土公鸡泄殖腔棉拭子样品中p27检出阳性率为87%(40/46),卵白检出率为74.7%(340/455);而卵黄中ALV-J和ALV-AB抗体阳性率分别为0(0/30)和80%(24/30)。无菌采集初步筛选p27抗原检测为阳性的5只HR土公鸡的抗凝血接种CEF,采用抗ALV-J和ALV-A的单克隆抗体进行IFA检测,结果显示5份样品中ALV-A和ALV-J的阳性率均为100%(5/5)。同时选取HR土鸡分离株HR332进行PCR扩增鉴定,结果表明分离株HR332存在ALV-J(HR332J)和ALV-A(HR332A)。其中,HR332J与11株ALV-J国内外参考株的同源性为92.4%～97.9%;HR332A与ALV-A参考株RSA-A、MQNCSU的同源性分别为90.1%和89.7%,与国内分离株SDAU09E2的同源性为99.0%。本研究显示,地方品种HR土鸡存在不同亚型ALV共感染,同时ALV-A和ALV-J共感染同一个鸡的现象已经存在。     

猪圆环病毒2型河北株的全基因组克隆与序列分析

采用降落PCR方法对采集自河北地区的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病料进行猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组的扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,分别命名为BD株和SJZ株,对其进行克隆、测定后,应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示:BD株全基因为1 767 bp,与黑龙江的BHD株同源性高达99.8%,SJZ株全长为1 768 bp,与北京的BJ株同源性最高为99.5%;对分离毒株与5个不同基因亚型的15个参考株的PCV2全基因组序列进化分析表明,发现分离的BD株为PCV2d亚型。     

鸡滑液囊支原体的RT-PCR检测及基因序列分析

为确诊某鸡场肉鸡发病死亡的病因,通过临床症状、病理变化、RT-PCR检测、病原S1基因序列分析进行综合诊断。结果:(1)病鸡表现食欲不振、精神沉郁、跛行及无法站立、关节肿大等症状,剖检发现肿大关节内有大量黏液。(2)鸡滑液囊支原体RT-PCR扩增出现207 bp特异性条带,与预期结果一致。(3)病原S1基因序列分析显示与GenBank公布的鸡滑液囊支原体基因序列同源性均达到99%,构建系统进化树分析显示与GenBank公布的参考株聚为1支。综合诊断为鸡滑液囊支原体感染。     

鸭瘟病毒、鹅细小病毒和番鸭细小病毒三重PCR检测方法的建立

为建立鉴别鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的多重PCR检测方法,参考文献合成针对DPVUL6基因、GPVNS基因和MDPVVP1基因序列的特异性引物。通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。结果显示,该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性,表明特异性较强;DPV、GPV和MDPV的最低核酸检出量分别为237.3pg、22.45pg和204.6pg,表明敏感性良好;该方法对DPV+GPV+MDPV、DPV+GPV、DPV+MDPV、GPV+MDPV、DPV、GPV和MDPV的核酸均能扩增出与预期大小一致的目的条带,表明该多重PCR方法重复性较好。本研究方法具有特异性强、敏感性良好、重复性较好和快速简便等特点,可用于DPV、GPV和MDPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。     

蛋鸡H5、H9亚型禽流感和新城疫免疫血清抗体与卵黄抗体检测比较分析

为分析蛋鸡免疫后卵黄抗体与血清抗体的相关性,试验采集经H5、H9亚型禽流感和新城疫疫苗免疫的黔东南小香鸡、乌蒙乌骨鸡、威宁鸡血清样本和卵黄样本,采用血凝抑制试验进行相关免疫抗体检测。结果:3个地方品种鸡的血清样本和卵黄样本中均可检测出H5、H9亚型禽流感和新城疫免疫抗体,且几何平均效价均大于24以上,达到免疫合格标准,不同地方品种鸡群间差异不显著(P>0.05);免疫后30d,卵黄样本免疫抗体几何平均效价低于血清样本,但差异不显著(P>0.05);免疫后60d,卵黄样本免疫抗体几何平均效价低于血清样本,差异显著(P<0.05)。结果表明:卵黄抗体与血清抗体呈正相关性,卵黄抗体几何平均效价均低于血清抗体。在临床上可用卵黄抗体替代血清抗体进行H5、H9亚型禽流感和新城疫疫苗免疫效果的评价,但应选择在免疫后30d以内。     

紫花苜蓿和黑麦草混合青贮过程中主要营养物质变化规律研究

为研究紫花苜蓿和黑麦草混合青贮过程中主要营养物质的变化规律,试验以贵州省常见紫花苜蓿和黑麦草按70∶30比例混合青贮,测定青贮第0、14、21、28、42、72、84、100、114、128、142d的主要营养物质含量。结果:从0~142d,随着青贮时间的延长,青贮饲料干物质中的粗蛋白含量逐渐降低,下降12.00%(P<0.05);中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量也呈逐渐下降趋势,分别降低17.87%、17.70%(P<0.05);粗灰分含量呈上升趋势,上升29.31%(P<0.05)。结果表明:青贮过程中随着青贮时间的延长会导致蛋白质流失,但也降低了纤维素水平,增加了青贮饲料的可消化性。     

贵州黄鸡蛋品质测定和相关性分析

为研究贵州黄鸡的蛋品质及各指标之间的相关性,随机抽取44周龄贵州黄鸡新鲜种蛋60枚,按照国家规定的方法,在24 h内测定相关指标。结果:贵州黄鸡平均蛋重为(52.74±5.33) g,蛋形指数1.36±0.10,蛋壳厚度(0.35±0.05) mm,蛋黄重(17.55±1.66) g,蛋黄颜色9.26±0.73,蛋白高度(4.72±1.13) mm,哈氏单位平均68.43±4.29。相关性分析表明:蛋壳强度与哈氏单位、蛋壳厚度呈显著正相关(P<0.05);蛋黄重与蛋重呈极显著正相关(P<0.01),与蛋黄比例和蛋壳厚度呈显著正相关(P<0.05);蛋重与蛋黄比例呈极显著负相关(P<0.01),与蛋白高度呈显著正相关(P<0.05);蛋白高度与哈氏单位呈极显著正相关(P<0.01);其他性状间无显著相关性(P>0.05)。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

猪排泄物中麻保沙星和盐酸沙拉沙星HPLC方法的建立

本研究建立了检测猪排泄物中盐酸沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)和麻保沙星(Marbofloxacin,MBF)2种氟喹诺酮类药物残留的高效液相色谱法,将采集的样品用甲醇:冰乙酸:去离子水=6:1:3的提取液进行提取,提取液用空气吹干。目标化合物采用HPLC-FLD检测,流动相为甲醇-柠檬酸溶液(0.05 mol/L),流速1 mL/min,进样量10μL,柱温35℃,荧光激发波长278 nm,发射波长495 nm。结果表明,SAR最低检测限为0.043 8μg/mL,MBF最低检测限是0.010 5μg/mL,猪排泄物中SAR和MBF在0.02～20μg/mL范围内呈良好的线性关系,R^2分别是0.999 9和0.999 8,猪排泄物中SAR的回收率是75.33%,MBF的回收率是82.05%,相对标准偏差小于10%,该方法对样品的前处理简单,对分析样品较为灵敏,可以对其检测分析提供参考。     

sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下沙门菌的转录组分析

为探明沙门菌(Salmonella)在sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下转录组变化情况。本试验采用HiSeq测序平台对沙门菌LT2菌株及其Hfq敲除株进行高通量测序,通过DESeq2差异分析方法筛选敲除sRNA伴侣蛋白Hfq条件下的差异表达基因,对其进行生物信息学GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。结果显示,对照组和试验组分别得到12 753 534条、8 254 308条Clean Reads。通过DESeq2差异分析获得差异基因1 055个,其中表达上调基因516个,表达下调基因539个。GO功能显著性富集分析表明显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、碳水化合物代谢过程等生物过程中。Pathway显著性富集分析表明显著差异表达基因富集到细菌趋化性、丙酸代谢和碳代谢等11个信号通路中。结果表明,本试验应用RNA-seq技术丰富了sRNA伴侣蛋白Hfq调控基因数量,筛选出20个受伴侣蛋白Hfq调控的显著差异表达基因,其中4个基因功能及编码蛋白未知,注释了差异表达基因的生物学功能及信号通路,推断Hfq在细菌对数期主要通过影响营养提供和趋化性等途径,继而影响细菌的正常生理活动,为Hfq协同sRNA的调控机理研究及sRNA靶基因的筛选奠定了基础。     

鲟源荧光假单胞菌的分离鉴定及药敏特性分析

从患病鲟体内分离到1株细菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16SrRNA基因序列分析及系统进化树构建等方法对分离菌种属进行确定,采用纸片扩散法对分离菌进行药物敏感性分析。结果显示:分离菌为革兰阴性杆菌;可分解葡萄糖和木糖,氧化酶和鸟氨酸脱羧酶试验阳性;16SrRNA基因测序分析与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)同源性大于99%,在系统发育树上与荧光假单胞菌聚为一枝;药敏结果显示,分离菌对氧氟沙星、多西环素、复方新诺明等敏感,对氟苯尼考、卡那霉素、阿莫西林等耐药;人工感染试验结果显示,该菌对小鼠有致病力。本研究为贵州地区鲟细菌性疾病预防及合理用药提供依据。     

过瘤胃蛋氨酸对黔北麻羊生长性能、养分表观消化率、血浆生化指标及瘤胃发酵的影响

本试验旨在研究过瘤胃蛋氨酸(RPMet)对黔北麻羊生长性能、养分表观消化率、血浆生化指标及瘤胃发酵的影响。选择18只体况良好、体重[(27.08±2.92)kg]和年龄相近的黔北麻羊,随机分为3组,每组6个重复,每个重复1只羊。对照组饲喂基础饲粮,Ⅰ、Ⅱ组在基础饲粮中每只羊分别添加5、10g/d的RPMet。预试期14d,正试期7d。结果表明:1)各组山羊生长性能指标差异不显著(P>0.05)。2)Ⅱ组粗蛋白质表观消化率显著高于对照组(P<0.05),各组其他养分表观消化率差异不显著(P>0.05)。3)各组血浆生化指标差异不显著(P>0.05)。4)各组瘤胃pH及挥发性脂肪酸浓度差异不显著(P>0.05)。由此可见,在现有饲养标准的基础上,饲粮中添加10g/dRPMet可提高黔北麻羊粗蛋白质表观消化率,且不影响生长性能、血浆生化指标及瘤胃发酵。