基于COⅠ基因序列对我国泰勒虫分类的研究

为理清泰勒虫中国分离株的分类地位,本研究首次对我国报道的5种泰勒虫9个地方分离株的COⅠ基因序列进行测定;并与GenBank中其它泰勒虫COⅠ和相应18S rRNA基因序列分别构建系统发生树,比较基于不同基因的分类结果。结果显示:9株泰勒虫的COⅠ基因大小在1214 bp~1 459 bp,与18S rRNA基因比较,COⅠ基因序列含有较多的变异位点及简约信息位点;基于两个基因的系统发育树,其拓扑结构大体一致。但也存在如下差异:环形泰勒虫不同分离株的聚类分析在COⅠ树中更趋于合理;有关东方泰勒虫和瑟氏泰勒虫命名的争论,本研究给出新的解释。因此,COⅠ基因可以作为新的标记基因用于泰勒虫的分类研究。     

牛的巴贝斯虫18S rRNA基因序列比较研究

对中国已报道的8株牛的巴贝斯虫（包括1株牛巴贝斯虫、1株双芽巴贝斯虫、1株大巴贝斯虫、3株卵形巴贝斯虫和2株巴贝斯虫未定种）的18S rRNA基因序列进行了测定与比较。自感染动物的血液中纯化虫体，提取基因组DNA，PCR扩增靶基因，然后将其连接到pGEM—T Easy载体上，进行克隆测序。研究结果显示：牛的巴贝斯虫18S rRNA基因大小在1653～1699bp之间；用所测得的和自GenBank下载的各种动物的巴贝斯虫18S rRNA基因序列构建了系统发生树，发现由刻点血蜱传播的大巴贝斯虫伊犁株与由长角血蜱传播的3株卵形巴贝斯虫存在明显差别，应属于2个独立种；由小亚璃眼蜱传播的牛巴贝斯虫未定种不同于目前已报道的任何种类，在中国应为一个新种。因而，中国存在5种牛的巴贝斯虫，即：牛巴贝斯虫，双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫，卵形巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种。     

我国羊巴贝斯虫trap基因结构及遗传进化分析

本研究拟解析我国羊巴贝斯虫trap基因的结构特征,并以其为分子标志开展遗传进化分析,为理清我国羊巴贝斯虫的分类关系提供数据。用公布的巴贝斯虫trap基因序列BLAST两个羊巴贝斯虫全基因组本地数据库,以获得的保守序列片段为模板,设计PCR引物;克隆我国分离的6株羊巴贝斯虫trap基因全长序列,分析其序列结构特征;比对序列相似性,构建系统发生树,分析其遗传进化关系。结果克隆获得6株羊巴贝斯虫trap基因,分析结果显示,其具有3、4、5个内含子的三种内含子数目,预测的开放阅读框(ORF)大小分别为1 944、2 100/2 142和2 286bp;氨基酸序列分析显示,其都具有TRAP蛋白家族特征性的vWFA、TSR、跨膜域和CTD结构域;进化关系分析显示,感染我国羊的巴贝斯虫被分成3组,组内序列相似性为99.8%~100%,而组间为43.6%~74.6%。系统发生树上6株羊巴贝斯虫被分到两大枝,羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,而且莫氏巴贝斯虫又被分成两小枝。6株羊巴贝斯虫trap基因结构存在差异,但其蛋白特征性的结构域较为保守;我国分离的羊巴贝斯虫为两个种,但莫氏巴贝斯虫中可能存在两个亚种。     

牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCT_η基因的克隆与生物信息学分析

对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列(AB367928.1)同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。     

三氮脒药物治疗对吉氏巴贝斯虫线粒体Cyt b基因的影响调查

旨在检测患病犬经三氮脒治疗后,吉氏巴贝斯虫线粒体细胞色素b(Cyt b)是否存在基因突变。调查了2010至2020年犬巴贝斯虫病的流行情况,收集了11份自然感染吉氏巴贝斯虫且接受三氮脒治疗的患犬血液样品,采用蛋白酶K消化,苯酚提取法提取血液中基因组DNA,设计引物,通过PCR扩增吉氏巴贝斯虫Cyt b基因片段并进行测序分析。调查发现,自2010年以来,通过三氮脒治疗的吉氏巴贝斯虫病的疗程逐渐延长,复发率也逐渐增加。在11份血样中,吉氏巴贝斯虫的Cyt b基因彼此之间相似性高达99.65%～100%,与日本分离株也有较高的同源性(99.18%～99.54%)。在Cyt b基因nt363基因位点上没有发现基因突变。这些结果说明虽然吉氏巴贝斯虫对三氮脒逐渐产生耐药,但三氮脒对吉氏巴贝斯虫Cyt b基因并不产生影响。     

18S rRNA序列差异在马梨形虫分类学中的应用

为揭示18S rRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026) 18S rRNA基因序列,在其V4高变区设计引物.将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序,正确的结果与其他种梨形虫的相应序列进行分析.系统发生树结果显示,泰勒虫和巴贝斯虫处于明显的两个分支,而称之为马巴贝斯虫的物种和泰勒虫有着较为密切的关系,他们处于同一分支,其亲缘关系较巴贝斯虫更远.序列对齐分析表明,巴贝斯虫核苷酸序列相对于泰勒虫种序列存在多个位点的缺失和突变.而马巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA V4高变区核苷酸序列的相似程度较高,与巴贝斯虫在该序列上的差异较大.以上结果表明,泰勒虫种和巴贝斯虫种18S rRNA V4高变区核苷酸序列间的这种缺失和突变可作为泰勒虫和巴贝斯虫分类依据的本质因素之一.马巴贝斯虫应隶属于泰勒虫科,泰勒虫属.     

东方巴贝斯虫的18S rRNA基因的扩增及系统发育研究

利用真核生物18S rRNA基因的PCR通用引物对寄生于中国水牛的巴贝斯虫（已命名为东方巴贝斯虫-BnbPsia orientalis）基因组DNA进行扩增，得到其18S rRNA全基因片段，测序后blast分析表明该虫种属巴贝斯虫无疑。将该基因1700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析，建立系统发育树。结果表明，东方巴贝斯虫与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近，与羊巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果说明水牛东方巴贝斯虫是一独立种。     

牛泰勒虫18S rRNA基因序列比较研究

作者对中国兽医微生物菌种保藏中心原虫资源库内收藏的3种牛源泰勒虫10个地方分离株(包括4株环.形泰勒虫、3株瑟氏泰勒虫和3株中华泰勒虫)的18S rRNA基因序列进行了测定,并用所测得的牛的泰勒虫中国株基因序列和自GenBank下载的各种泰勒虫18S rRNA基因序列构建了系统发生树.结果显示;牛的3种泰勒虫18S rRNA基因大小在1 740～1890 bp,并有规律地分布于3个不同的进化枝上,且种内地方分离株之间的同源性明显大于种间同源性,说明采用18S rRNA基因序列测定方法对牛的泰勒虫进行分类与传统分类方法具有较好的符合性.该研究也可为建立针对18S rRNA基因为靶标的牛的泰勒虫病PCR检测方法奠定基础.     

驽巴贝斯虫病PCR检测方法的建立和应用

根据驽巴贝斯虫(Babesia caballi)18S rRNA基因序列设计1对特异性引物,扩增出452 bp核苷酸片段,建立了检测驽巴贝斯虫病的PCR方法。敏感性试验结果表明,该方法最低能检出0.01 fg/μL驽巴贝斯虫DNA模板。特异性试验结果显示,在被检测的6个巴贝斯虫株中,仅驽巴贝斯虫株能扩增出特异性片段,马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫的扩增结果均为阴性。对45份马属动物血样进行检测,本研究建立的PCR方法测得驽巴贝斯虫病的阳性率为26.67%(12/45),与显微镜检测方法进行了比较,结果显示PCR检测方法可显著提高驽巴贝斯虫的检出率。     

云南部分地区牛羊寄生蜱媒梨形虫的流行病学研究

为了了解云南省玉溪市、昆明市、楚雄市和普洱市牛羊寄生蜱媒梨形虫的流行情况,试验从上述4个地区牛羊体表共采集455份蜱样本,基于形态学和cox1基因序列对寄生蜱进行物种鉴定,通过扩增梨形虫18S rDNA基因及序列分析对寄生蜱媒梨形虫进行鉴定,并统计不同地区、不同宿主寄生蜱媒梨形虫的阳性率,分析寄生蜱感染巴贝斯虫和泰勒虫的风险因素(所在地区、宿主种类)。结果表明：采集的蜱均为微小扇头蜱。在455份蜱样本中,共鉴定到5株巴贝斯虫,其中4株为双芽巴贝斯虫,1株未定种;共鉴定到60株泰勒虫,其中54株为东方泰勒虫,6株未定种。选取2株双芽巴贝斯虫和4株东方泰勒虫构建遗传进化树,其中双芽巴贝斯虫CX-370和CX-369与双芽巴贝斯虫参考株(GenBank登录号为KY805825.1、AY603402.1)和巴贝斯虫参考株(GenBank登录号为KP410277.1)位于的同一分支,未定种的巴贝斯虫CH-367为独立分支且与上述虫株汇聚为一支,东方泰勒虫PE-423、CJ-374、KM-106和PE-394与东方泰勒虫参考株(GenBank登录号为MH208640.1、MH208639.1、MH...     

牛卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因的扩增测序及系统进化分析

为了解卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因的结构及功能特性,采用PCR方法对其HSP70基因进行扩增测序及系统进化分析.结果:结构分析显示,卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因片段大小为1947 bp;测序结果显示,卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因与卵形巴贝斯虫日本株(XM_029011319)同源性为99.8％,与双芽巴贝斯...     

甘肃省河西区域牛羊梨形虫病病原及媒介蜱分子流行病学调查

巴贝斯虫（Babesia spp.）和泰勒虫（Theileria spp.）是世界范围内流行的蜱传播梨形虫病病原体。为评价梨形虫病传播情况,为甘肃省河西区域梨形虫病防治提供流行病学资料,采集该区域部分县区的牛羊抗凝血样品和环境游离蜱虫进行梨形虫病病原检测,分析样品中病原体的存在和分布情况,利用MEGA 6.06软件和NCBI GenBank数据库的BLASTn工具,对阳性样品中的巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA基因进行序列分析和遗传进化树构建。通过基于18S rRNA的巢氏PCR方法,检出梨形虫病病原1目2科9种,包括莫氏巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和隐藏巴贝斯虫3种巴贝斯虫,东方泰勒虫、中华泰勒虫、分离泰勒虫、吕氏泰勒虫、狍泰勒虫和环形泰勒虫6种泰勒虫。牛羊抗凝血样品梨形虫病病原总感染率为8.84%（16/181）,阳性样品分布于武威市（感染率14.94%）和张掖市（感染率3.45%）;检出携带梨形虫病病原的蜱9只,蜱病原携带率为2.52%（9/357）。检出的梨形虫病病原分属泰勒虫属和巴贝斯虫属2大类,每种病原跟国内外检出虫株的同源性均较高,处于各虫株相应分支上,提交序列相似率达99%～...     

产丁二酮的嗜热链球菌的筛选和鉴定

从酸马奶中分离出五株链球菌，其中KM18的丁二酮的产量为20mg／mL。利用PCR扩增该菌的16SrRNA基因，将测序结果同该属内菌株的16SrRNA基因序列作多序列比较，并建立链球菌属的系统发育树。结果表明，KM18的16SrRNA基因序列同S．thermophilus的同源性百分比为98．2％。综合系统发育树的结果，将KM18鉴定为S．thermophilus。菌株KM18的16SrRNA基因序列已经在GENBANK申请国际序列注册号，为D0176426。     

识别牛巴贝斯梨形虫的特异性DNA探针

用质粒PuN121从墨西哥虫株M建立牛巴贝斯梨形虫DNA的基因族,并克隆于大肠杆菌上,选择几个与标记的牛巴贝斯梨形虫基因DNA杂交的重组质粒,进一步分析,发现PMu—B_1敏感性较高,能检测出25pg纯净的牛巴贝斯梨形虫DNA。10μl感染全血中300个梨形虫或0.00025％虫血症,PMu—B_1含有6.0kb牛巴贝斯梨形虫DNA插人物,该插人物不与双芽巴贝斯梨形虫、伊氏锥虫、恶性疟原虫、边缘边虫、微小牛蜱和奶牛DNA发生交叉反应,基因组DNA Southem印迹析,PMu—B_1能识别两种牛巴贝斯梨形虫地方株,即墨西哥虫株M和泰国TS_4株,因此,PMu—B_1探针可用于诊断牛和蜱巴贝斯梨形虫感染及识别牛巴贝斯梨形虫虫株。     

11株螨虫分离株的ITS-2序列分析与系统关系研究

为探讨动物体上一些常见寄生螨虫的分类地位,对11株螨虫分离株的核糖体第二内部转录间隔区(ITS-2)基因序列进行测定,并从GenBank下载21条螨虫的ITS-2序列,用UPGMA法构建分子系统树.序列分析结果显示:6株疥螨分离株ITS-2基因全长均为361 bp,含有335个保守性位点,15个变异位点和9个简约信息位点;序列间的同源性为96.9%～99.7%.5株足螨分离株ITS-2基因存在长度上的变异(225～232 bp),序列中包括184个保守性位点,44个变异位点,9个简约信息位点;分离自黄牛和奶牛的4株足螨分离株的ITS-2序列同源性为92.4%～97.3%,而熊猫足螨分离株同黄牛、奶牛足螨分离株的同源性较低(78.7%～82.6%).UPGMA显示:32株螨虫分离株分成2个支系,第1个支系包括疥螨科的疥螨属Sarcoptes和背肛螨属Notoedres;第2个支系包括痒螨科的足螨属Chorioptes和痒螨属Psoroptes.从分析结果来看,笔者支持疥螨的单种说法;而足螨属中分离自熊猫的足螨和痒螨属中分离自水牛的痒螨的分类地位还有待进一步探讨.     

延边地区牛卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查

为了解牛卵形巴贝斯虫病在吉林省延边地区流行情况,本试验应用PCR方法对珲春地区190份牛的血液样本进行牛巴贝斯虫病的分子流行病学调查,并与血液涂片染色镜检法进行了比较。结果该地区牛巴贝斯虫病的PCR方法检测阳性率为30.52%,而血涂片染色镜检法的阳性率为11.05%。不同地区和不同饲养方式间牛卵形巴贝斯虫感染率差异显著(P<0.05)。遗传进化分析显示,吉林省延边地区牛卵形巴贝斯虫与日本分离株处于同一分支,而区别于河南和韩国分离株。调查表明,吉林省延边地区是牛卵形巴贝斯虫病的流行地区。     

驽巴贝斯虫病巢式POR检测方法的研究

针对驽巴贝斯虫(Babesia caballi)rap-1基因序列设计内外两对引物,从实验室感染驽巴贝斯虫的马匹上采集全血提取DNA,采取两次扩增的方法,获得222bp基因片段,经测试此靶序列为驽巴贝斯虫特异性基因片段.采用本研究方法对已知的阳性马匹和阴性马匹进行检测,准确率为100%.     

驽巴贝斯虫病巢式POR检测方法的研究

针对驽巴贝斯虫(Babesia caballi)rap-1基因序列设计内外两对引物,从实验室感染驽巴贝斯虫的马匹上采集全血提取DNA,采取两次扩增的方法,获得222bp基因片段,经测试此靶序列为驽巴贝斯虫特异性基因片段。采用本研究方法对已知的阳性马匹和阴性马匹进行检测,准确率为100%。     

3株不同宿主源弓形虫分离株GRA7基因的克隆与序列分析

对分离于江苏地域的3株不同宿主源弓形虫YZ-1(ChineseⅠ基因型)、YZ-2(ChineseⅠ基因型)和KS(基因型Ⅰ型)分离株的GRA7基因的全长序列进行克隆与序列分析,结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明:KS株的GRA7基因完整开放阅读框长711 bp,与RH参考株完全一致;YZ-1和YZ-2株GRA7基因序列均为708 bp,与KS株相比在290-292位点缺失3个碱基;氨基酸序列和抗原表位分析显示,YZ-1和YZ-2株的GRA7蛋白在97位缺失1个谷氨酸,但比KS和RH株多1个抗原表位。结果表明,GRA7基因可区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型虫株,ChineseⅠ型与Ⅱ型虫株的亲缘关系最近;ChineseⅠ型GRA7基因在290-292位点缺少3个碱基,其GRA7蛋白多1个抗原表位。     

牛卵形巴贝斯虫不同靶基因PCR检测方法的比较

旨在筛选出检测牛卵形巴贝斯虫特异、敏感的PCR方法。本试验以牛卵形巴贝斯虫18S rRNA、AMA-1和CCTη基因为靶基因进行PCR检测,从敏感性、特异性和临床检出率方面进行比较。结果显示,以18S rRNA基因的PCR方法敏感性最高,最小检出率为16 fg/μL;以CCTη为靶基因的PCR方法敏感性最低,检测量为1.6 pg/μL;而以顶膜抗原(AMA-1)为靶基因的PCR方法的最低检测量为160 fg/μL。三种靶基因均扩增不出牛瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫基因片段。通过60份临床血液样本的检测结果表明,以18S rRNA基因设计引物的检出率最高,为30%(18/60),明显高于以AMA-1基因25%(15/60)和CCTη基因21.67%(13/60)。本试验为卵形巴贝斯虫病的诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。