华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

为了解华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株变异情况,本研究以RT-PCR技术对山东、福建发病猪场的41份组织样品进行PRRSV检测和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)相关毒株(HP-PRRSVLike)检测,对阳性样品进行PRRSV分离、ORF5基因测序及变异分析。结果显示,福建、山东样品的阳性率分别为56%、74%;共分离到16个美洲型毒株(福建10株、山东6株),分属于Lineage 8、Lineage 5、Lineage 3、Lineage 1四个谱系,其中以Lineage 8为主。这表明PRRSV流行毒株多样化,跨谱系毒株重组值得警惕。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析

为了解近年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的分子遗传变异情况,对2019年来自8省的46株PRRSV测序并进行ORF5基因分析比较。结果表明,送检测序的46株PRRSV均属于北美型,同源性对比结果显示,与欧洲毒株LV的同源性为61.4%～64.0%,与谱系1代表毒株NADC30和MN184B的同源性为82.9%～95.0%,与谱系3代表毒株GM2同源性为82.1%～92.4%,与谱系5代表毒株VR2332和MLV同源性为83.6%～89.6%,与谱系8经典毒株CH-1a的同源性为83.1%～95.2%,与谱系8过渡毒株BJ0706的同源性为81.6%～97.5%,与谱系8高致病性蓝耳毒株JXA1、HuN4、TJ的同源性为81.4%～99.7%;氨基酸分析结果表明,46株PRRSV主要以点突变为主,未见插入突变,与不同谱系代表毒株相比,在中和表达位点及N-糖基化位点均存在一定变异。由此可知,PRRSV野毒仍在不断的发生变异。     

猪繁殖与呼吸综合征3种毒株多重PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列设计2对特异性引物,第1对通用引物扩增美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因(466bp/376bp),第2对引物特异性扩增欧洲型毒株ORF7基因(580bp)。反应条件优化后,建立了能够同时检测美洲型经典毒株、美洲型变异毒株和欧洲型毒株的多重PCR检测方法。该方法可以特异性扩增3种毒株的基因,目的基因片段大小差异在90bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。应用该方法检测183份临床疑似病例,结果 PRRSV阳性35份,其中美洲型经典株2份,美洲型变异株31份,欧洲型毒株3份,美洲型变异株和欧洲型毒株混合感染1份。表明建立的多重PCR检测方法具有快速、准确、敏感等优点,对PRRSV 3种毒株的快速诊断有十分重要的意义。     

2016年-2017年广东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为研究广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遗传演化情况,采用RT-PCR方法对2016年-2017年采自广东省地区猪场疑似PRRS猪肺脏组织样品中的PRRSV ORF5基因进行了扩增,并对这些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析.结果表明,成功扩增出12株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段.遗传演化分析表明,扩增出的毒株有10株与国内高致病性毒株亲缘关系较近,属于同一分支;2株与广东地区新报道的毒株QYYZ和GM2亲缘关系较近,属于同一分支.氨基酸序列比对结果表明,新分离的毒株在GP5抗原表位上存在广泛的变异.结果表明,该地区PRRSV毒株已经发生广泛变异.研究结果不仅揭示了广东地区流行的PRRSV ORF5基因的遗传演化特性,也为该地区PRRS的防控提供了科学依据.     

河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析

为了解河北省猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况及毒株遗传变异趋势,应用RTPCR方法,对河北省10个地区的18个发病猪场进行调查,分别扩增出23株缺失部分NSP2基因和完整ORF5基因的毒株。序列分析结果显示,23株PRRSV NSP2基因均缺失了不连续的30个氨基酸,从而证实河北省存在美洲型PRRSV变异株的流行。23株PRRSV ORF5核苷酸序列与国内外已发表的基因序列绘制的遗传进化树表明:20个毒株与JXA1形成一个基因亚群;而另3个毒株与NADC30毒株形成一个基因亚群,并且变异最大,是以后的主要临床研究对象。推导编码氨基酸的比较结果表明,河北省流行的PRRSV毒株ORF5基因编码蛋白已发生较大变异,需在今后临床诊断与疫苗防控中引起重视。     

PRRSV河北分离株ORF5与NSP2基因遗传变异分析

从河北省新乐市某猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的病料,通过Marc-145细胞培养,RT-PCR检测等方法鉴定,确认分离到1株PRRSV,暂命名为HB-XL株。进一步对其ORF5与NSP2基因克隆测序,经同源性比较及系统进化树等分析,表明该毒株ORF5与NSP2基因与国内流行的缺失变异株遗传关系较近,与国内外经典美洲型毒株及基因重组毒株QYYZ遗传关系较远且与欧洲型LV毒株处于不同分支;ORF5基因编码的200个氨基酸的第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),第137位为具有野毒特性的丝氨酸(S);与经典美洲株相比,该毒株NSP2基因分别发生3个碱基和87个碱基的不连续缺失。说明HB-XL株属于美洲型PRRSV并存在不断变异的趋势。     

1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析

对山东省某地区初诊为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproduction and respiatory syndrome,PRRS)的猪病料采用RT-PCR进行鉴定,获得1株PRRSV并命名为SD18。对该分离株的第2代细胞培养毒株进行全基因组测序,与其他参考毒株比较同源性并构建遗传进化树。结果显示,SD18毒株属于美洲型高致病性PRRSV变异株,该毒株Nsp2基因具有31个不连续的氨基酸缺失,已明显区别于以JXA1、HUN4、TJ株等为代表的30个不连续缺失高致病性分离株,其中第830位氨基酸位点是最新发现的缺失氨基酸。同时,该毒株的ORF3基因第17位插入1个丝氨酸(S),而ORF5基因编码的第13位和第151位氨基酸均为具有强毒特性的精氨酸(R),第137位则插入了具有野毒特性的丝氨酸(S),这4个氨基酸位点也表现出不同于以往高致病性毒株变异的特征。采用基因重组分析软件RDP4分析表明,该新型缺失株的多个部位发生了基因重组;SD18毒株病毒以美洲经典毒株VR2332作为重组的主要亲本毒株,疫苗株JXA1-R和新型毒株NADC30-like提供重组片段,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化。本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据。综合分析表明,山东地区SD18分离株Nsp2、GP3、GP5相应氨基酸均出现了较大变异,特别是Nsp2出现一个新的氨基酸缺失,可能是该毒株形成了一个新的独立变异分支的重要原因;这些变异也提示该分离毒株在病毒编码蛋白及其免疫原性等方面出现了较大变化。该病毒株的成功分离鉴定与遗传进化分析为PRRSV衍化及流行病学调查积累了最新数据,也为预防控制该病提供参考。     

山东及周边部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异与遗传演化分析

为了解中国山东及周边部分地区自2017年以来猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的分子流行病学特征、基因组变化规律,作者收集来自山东省、河南省和江苏省的部分猪场采集及送检的疑似PRRS症状猪组织样品70份,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测。对部分阳性病料中PRRSV的基因重组、决定中国高致病性PRRSV(HP-PRRSV)致病性和复制力的Nsp9第561、586和592位氨基酸等进行分析,以探明该区域PRRSV的遗传演化规律。结果显示,PRRSV检出率为55.7%,从上述样品筛选11株PRRSV分离株。Nsp2序列分析显示,与经典美洲毒株VR-2332相比,7株PRRSV分离株的Nsp2蛋白分别在第481及533-561位发生了30个氨基酸的不连续缺失,这与我国自2006年以来流行的HP-PRRSV的缺失特征相同;2株PRRSV分离株的Nsp2蛋白在481、533-561及595-597位发生了三个部位的共33个不连续氨基酸的缺失;2株PRRSV分离株的Nsp2蛋白在475-518及533-561位出现了两个部位的共73个不连续氨基酸的缺失。该研究中PRRSV分离毒株的Nsp2基因已发生了明显的新型缺失。采用基因重组分析软件RDP4分析显示,以上后4株新型缺失株存在较大的基因重组,且重组部位和重组片段数量不相同;4株病毒均以高致病性毒株JXA1作为重组的主要亲本毒株,多数重组变化集中在Nsp2蛋白区域,在其他非结构蛋白和次要蛋白区域也可见部分重组变化。另外,Nsp9第561、586和592位氨基酸变异分析显示,该4株病毒在上述三个氨基酸位点与中国HP-PRRSV相符。本研究为深入探索PRRSV的遗传变异规律及相关生物学特性研究积累了数据。     

充分认识蓝耳病对养猪业的危害

一、对猪蓝耳病的认识(一)充分认识蓝耳病病毒的变异特性蓝耳病病毒(PRRSV)是变异率较高的病毒之一。当前我国猪群中流行的PRRSV流行株呈现多样化趋势,不同毒株之间出现基因重组,活疫苗毒株与流行毒株     

一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株的基因组特征

为了监测我国近年来流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR分段扩增,对2009年从山东发病猪场分离到的1株PRRSV SD0901的全基因组进行了序列测定和分析.结果表明,不包括Poly(A)尾,该毒株的基因组全长为15 320 nt;与高致病性PRRSV毒株间的全基因组核苷酸相似性为98.6％～98.7％;该毒株基因组的Nsp2编码区除存在与高致病性毒株相同的30个氨基酸的不连续缺失外,还存在468位的氨基酸缺失和在585-586位间插入1个氨基酸,同时,该毒株的结构蛋白GP2、GP3、GP4和M编码区分别存在1个氨基酸的突变.演化分析表明,该毒株尽管与高致病性毒株属于同一亚群,但形成一个独立的小分支.由此表明,该毒株为高致病性PRRSV的变异毒株,说明我国的高致病性PRRSV在流行过程中已出现变异.笔者的研究结果为监测和分析我国的高致病性PRRSV的变异与演化提供了有价值的基因组信息数据.     

Re-emerging of porcine respiratory and reproductive syndrome virus (lineage 3) and increased pathogenicity after genomic recombination with vaccine variant

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was first reported in China since late 1995 and several variants were further reported in subsequence years, causing huge economic losses to the Chinese swine industry. To date, three major lineages (lineage 3, 5.1 and 8.7) of Type 2 PRRSV were reported in China based on our global genotyping. The present study provides the epidemiology of the PRRSV in South China based on the isolates collected during 2009–2012, indicating three lineages (lineage 3, 5.1 and 8.7) of Type 2 PRRSV were still circulating in this area. Our phylogenetic reconstruction indicated that lineage 3 re-emerged in 2010 formed a huge cluster with closely related to the 2004 isolates from Hong Kong. Furthermore, the inter-lineage genomic recombination between MLV vaccine strain (lineage 5) and a recently re-emerged lineage 3 virus (QYYZ) has also been found in a farm practicing MLV vaccination. Our in vivo experiment comparing the pathogenicity and clinical presentations among currently isolated viruses indicated that pigs infected with recombinant lineage 3 virus (GM2) showed persistent higher fever compared to pigs infected by its wild counterpart (QYYZ). This study enhanced our understanding on potential importance of the recombination of PRRSV along with their evolution.     

8株分离自四川、贵州地区猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株的全基因组特征分析

本研究旨在了解近年来我国四川、贵州地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的分子流行病学及遗传变异情况,对该地区2016—2018年间采集的8份PRRSV阳性样品进行病毒分离鉴定和全基因组测序,进一步使用RDP4和Simplot生物软件对全基因序列进行重组分析。结果显示,8个PRRSV毒株全基组全长为15 010~15 321 nt,毒株间相似性为80.9%~91.7%。NSP2氨基酸分析结果显示,4个毒株表现出与HP-PRRSV毒株一致的30 aa缺失,另外4株表现出与NADC30毒株一致的131 aa缺失。其中,GZgy17表现为“1+19+29 aa”新型缺失模式。ORF5氨基酸分析显示,3个毒株在33位点出现新型的1 aa缺失。遗传重组分析显示,8个毒株表现出PRRSV-2毒株6种不同谱系（Lineage）间的重组方式,分别如下：1） SCnj16：L8+L1;2） SCxyz17：L1+L5;3） SCya18：L1+L3;4） GZgy17：L8+L3;5） SCcd17和SCN17：L1+L8+L5;6） SCcd16和SCya17：L1+L8+L3。本研究结果表明,我国四川、贵州地区不仅有多种谱系PRRSV毒株并存,其基因组还出现了复杂的遗传重组现象,具有上述复杂基因组的PRRSV毒株在我国的流行状况值得高度关注。     

2018年四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的分子流行病学调查研究

为研究四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行及进化趋势,本研究以GP5蛋白为研究对象,对2018年间收集的378份四川省不同区市县PRRSV疑似病料进行了实时荧光定量PCR检测,并对部分毒株ORF5基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行进化分析和N-糖基化位点预测。通过疑似病料实时荧光定量PCR检测,共检出阳性样品69份,阳性率为18.25%。对其中23株PRRSV的ORF5基因序列分析结果显示,ORF5基因之间核苷酸同源性为81.6%~100%,推导的氨基酸同源性为81.4%~100%,均属于美洲型毒株。其中,1株属于以经典毒株VR2332为代表的亚型Ⅰ,17株属于以高致病毒株JXA1为代表的亚型Ⅱ,5株属于重组毒株NADC30为代表的亚型Ⅲ,说明2018年间四川省PRRSV流行毒株存在基因多样性,HP-PRRSV依然是主要流行毒株,但仍存在不断进化的经典毒株,同时,类似NADC30和QYYZ的重组毒株也开始出现。通过氨基酸突变位点和N-糖基化位点分析发现,23株PRRSV在GP5两个重要抗原表位相关区域和毒力相关位点均发生了一定程度的突变,推测这些突变可能影响了病毒逃避机体免疫和病毒毒力,提示在PRRSV防控中,应该加强遗传进化分析,根据不同类型的毒株选择有针对性的疫苗和防控策略。     

1株类NADC30与类JXA1重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传特征分析

旨在分析本实验室2017年从临床病料中分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的分子遗传特征,测定了其全基因组序列,并运用生物信息学软件对其遗传特点进行了分析。结果显示,该毒株基因组全长15 054 bp,与代表性毒株VR-2332、NADC30、CH-1a、JXA1和QYYZ的核苷酸相似性分别为84.5%、93.4%、84.2%、83.9%和82.1%。系统进化树分析显示,该毒株与NADC30-like毒株处于同一进化分支,属于lineage 1。基于GP5和Nsp2蛋白的氨基酸序列分析显示,分离株GP5蛋白糖基化位点位于34位、44位和51位;在37-45 aa的线性表位区较为保守,在27-30 aa和37-45 aa的线性表位区存在特异的氨基酸位点变异;Nsp2蛋白存在NADC30-lke毒株特征性的131个（323-433位、483位、504-522位）不连续氨基酸的缺失。基因重组分析显示,该毒株以类NADC30为主要亲本、以类JXA1为次要亲本,在Nsp2的氨基端（1 340-2 082 nt）发生了基因重组。本研究成功绘制了1株NADC30-like毒株的基因组遗传特征,确定了其在Nsp2区域发生了基因重组,提示PRRSV通过基因重组在不断发生遗传演化,开展持续的PRRSV流行及遗传变异监测对于该病的防控具有重要意义。     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

Molecular evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from central China

To investigate the genetic diversity of prevailing porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Henan Province of China, 61 ORF5 gene sequences, originating from Henan Province during 2003–2010, were subjected to amino acid variation and phylogenetic analysis. The analyzed PRRSV ORF5 sequences carried evidence of one unique recombination event. Phylogenetic analysis revealed that all Henan isolates belonged to type 2 genotype and were divided into two subgroups. The dominant isolates had shifted from subgroup 1 to subgroup 2 during 2003–2010. Amino acid variation analysis of the glycoprotein 5 revealed that Henan PRRSV strains tended to accumulate more substitutions within the N-terminus and hypervariable region. Selective pressure analysis revealed evidence that some ORF5 sites have likely evolved in response to immune pressure.     

转录组测序技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能导致母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难等症状,严重威胁全球养猪业的健康发展。目前,PRRSV的致病机制及其与宿主的互作机理并不完全清楚。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,转录组测序技术已被广泛应用于PRRSV的研究中,为深入解析PRRSV的致病机理及其与宿主的互作机制提供了一种全新的研究工具。作者从感染应答、蛋白功能、毒株、疫苗、抗病品种5个方面对近年来转录组测序技术在PRRSV研究中的应用进行了综述分析,对其筛选的差异表达基因(DEGs)和通路进行总结,以期为未来PRRSV转录组学研究提供参考。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。