温和气单胞菌毒力基因的检测及其对鲫鱼致病性试验

为探究温和气单胞菌菌株A.S1的致病性,采用PCR方法扩增溶血素基因(hly)、细胞兴奋性肠毒素基因(alt)、黏附素基因(aha1)和气溶素基因(aerA)4种毒力基因,并运用动物回归试验探究菌株A.S1对鲫鱼的致病性。结果表明,菌株A.S1可扩增出hly、aha1和alt 3种毒力基因,未扩增出aerA基因。动物回归试验显示,试验组鲫鱼在腹腔注射温和气单胞菌0.3mL(浓度为1.5×108 CFU/mL)后,5d内死亡率达100%。表明毒力基因型为hly+、aha1+、alt+和aerA-的菌株A.S1为高毒力菌株,且菌株的毒力基因型与致病性呈正相关。     

锦鲫致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定长春市某水产养殖场发病锦鲫(Brocaded crucian)病原菌,本研究从患病锦鲫体内分离得到一株优势菌株,并对其进行了常规理化特性、分子生物学、人工感染试验及药敏检测。结果显示:分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,其理化特性与维氏气单胞菌(A.veronii)特征相符,并且其16S r DNA基因、gyr B基因、dna J基因、rpo D基因与Gen Bank中A.veronii相应基因序列的同源性均高达99%,在系统进化树中与A.veronii聚为一族,将其命名为JLND-1611;人工感染试验结果显示,锦鲫感染7 d后全部死亡,临床症状与自然病例相似,而且对斑马鱼LD_(50)为1.51×10~(2.67)cfu/m L;毒力基因检测显示,从JLND-1611可以扩增出6种毒力因子:脂肪酶(lip)、核酸酶(exu)、密度感应系统调控基因(luxs)、粘附素(aha)、气溶素(aer)及氨酸蛋白酶(ser);综合检测结果表明该分离株为致病性A.veronii。药敏试验结果显示,分离株对19种抗菌药物中头孢曲松、头孢哌酮及多西环素等药物敏感。本研究为锦鲫感染A.veronii的鉴定及治疗药物的选取提供了参考依据。     

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株气溶素基因的生物信息学分析及原核表达

为深入研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)毒力因子气溶素(aerA),本实验从框镜鲤A.veronii CY0806株中克隆aerA基因,进行同源性分析和构建系统进化树,并进行生物信息学分析、诱导表达和检测.结果表明aerA基因全长1 471bp,编码490个氨基酸,CY0806株aerA与A.veronii EF620533.1株同源性为95％,与EF620533.1、AB109093.1和ET034117.1在同一分支;推测其相对分子质量约为54.33ku,理论等电点为5.90,摩尔消光系数为138 810,半衰期为30 h(体外培养的哺乳动物网状细胞),不稳定性系数为31.87,脂肪系数为71.86,总平均疏水性为-0.445; aerA蛋白具有信号肽,不存在跨膜区,二级结构分析表明aerA蛋白结构比较复杂.本研究对aerA基因进行了原核表达,产物具有一定的免疫原性.研究结果为进一步研究A.veronii aerA的功能和诊断、防治奠定基础.     

黄金鲫致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

为确定吉林省黄金鲫鱼发病死亡的原因,从患病黄金鲫体内分离到致病菌JLJ-1,对该菌进行形态学观察及生理生化特性的鉴定,并对16S rDNA和管家基因gyrB、rpoD、dnaJ序列、毒力基因携带情况及耐药性进行了分析。结果表明,该菌为革兰阴性菌,结合细菌形态学特征及其生理化生化特性与维氏气单胞菌(Aerornonas veronii,A.veronii)基本相同;16S rDNA与gyrB、rpoD、dnaJ序列进化比对分析显示,该病原菌与A.veronii同属一个分支,且同源性较高。将分离菌人工感染黄金鲫,7d后黄金鲫全部死亡,且临床症状与自然病例相似。通过毒力基因检测发现,JLJ-1株可扩增出6种毒力因子:气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)及脂肪酶(lip)。药敏试验显示,该菌对氟苯尼考、头咆哌酮及头炮曲松等药物比较敏感。本研究为黄金鲫感染A.veronii的鉴定及治疗药物的选取提供科学依据。     

猪源杀鲑气单胞菌分离鉴定及毒力因子检测

为了确定河南省某猪场导致保育仔猪死亡的病原菌,从病死猪的肺脏、肝脏和脾脏分离得到一株优势菌。结果显示,经16S rDNA测序确定该优势菌为杀鲑气单胞菌;动物致病试验显示,分离菌株对小鼠具有致病性;药敏试验显示,该分离菌对磺胺异噁唑、四环素、土霉素、阿莫西林/克拉维酸、卡那霉素、氨苄西林等耐药;毒力基因PCR检测显示,act、ast、fla、lipase毒力基因为阳性,alt、elastase为阴性。本研究首次从发病猪体内分离到杀鲑气单胞菌,并为该条件致病菌的诊疗提供参考依据。     

牛蛙源达卡气单胞菌的分离鉴定及毒力特性分析

采用细菌形态与生化鉴定方法并结合16S rRNA及gyrA基因测序分析,对海南省文昌市某养殖场死亡牛蛙病变组织中分离获得的1株优势菌株WC0803进行鉴定,并对其进行致病性试验、药物敏感性试验及耐药基因和毒力基因检测。结果显示,该菌株为革兰阴性短杆菌,培养特性、生化反应与达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)基本一致;16S rRNA和gyrA基因同源性及系统进化分析显示,WC0803菌株与达卡气单胞菌参考菌株同源性大于99%,且为同一进化分支。该菌对头孢噻肟、环丙沙星、恩诺沙星等7种抗生素敏感,对头孢氨苄、万古霉素、磺胺异恶唑和链霉素等10种抗生素耐药;携带耐药基因qnrA、qnrS、ant3、tem、ctxM,毒力基因ascV、aer、act、ast、lip、ela和fla;对牛蛙的半数致死量(LD50)为4.68×10⁶CFU/mL,具有较强的致病性。本研究首次从患病牛蛙体内分离出一株强致病性达卡气单胞菌,为该菌感染的防治提供科学依据。     

滑鼠蛇嗜水气单胞菌的分离鉴定

为鉴定一起引起滑鼠蛇死亡的致病菌,本研究对采集病理样品中分离菌进行了细菌形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA序列分析、耐药性测定及毒力相关基因检测。结果显示分离菌为嗜水气单胞菌。进化树分析表明该分离菌与来自中华鳖的嗜水气单胞菌N3株亲缘关系最近;药敏试验显示,分离菌株对强力霉素、庆大霉素、头孢呋辛等药物高度敏感,对四环素、阿奇霉素、链霉素等药物中敏,对头孢氨苄、青霉素、阿莫西林、林可霉素、万古霉素等药物完全耐药,表明该分离菌株具有多重耐药性;小鼠毒力试验和毒力相关基因检测显示,该菌含有的5种毒力相关基因为aer A、hly A、ahp A、ast及alt;并在3×108 cfu/0.3 mL的感染剂量下可致小鼠全部死亡。本研究结果表明引起此次蛇细菌感染的病原为嗜水气单胞菌,该菌的分离鉴定为其感染引起的传染病防治提供了实验依据。     

红鲫豚鼠气单胞菌的分离鉴定与毒力、耐药特性分析

为探究长春市某观赏鱼水产养殖基地患病红鲫的病原及特性,采用菌落特性、理化特征、16S rDNA以及gyrB测序结果相结合的方法对病鱼肝脏组织中分离得到的1株优势菌株CI0701进行分析鉴定;同时,进行回归动物试验、药物敏感性试验、毒力基因及耐药基因检测。鉴定结果表明,该菌与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)聚类,且同源性高达99%以上;后续试验结果发现CI0701具有较强致病性,对红鲫和斑马鱼的半数致死量(LD₅₀)分别为4.3×10³、5.56×10 CFU/尾;该菌对红霉素、四环素、新霉素、氨苄西林、环丙沙星等12种药物耐药,属于多重耐药菌;携带溶血素(hly)、气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、脂肪酶(Lip)、丝氨酸蛋白酶(Ser)和鞭毛蛋白(fla)7种毒力基因;携带氨基糖苷类[ant(3″)-Ia]、四环素类(tetA)、大环内酯类(ermB)、喹诺酮类(qnrS)和β-内酰胺类(bla_TEM)5种耐药基因。本研究可以为红鲫携带豚鼠气单胞菌的分离鉴定以及治疗...     

框镜鲤致病性维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测框镜鲤致病性维氏气单胞菌(A.veronii)双重PCR方法,本研究以A.veronii CY0806株和国际标准株DNA为模板,分别以16S rRNA和Aer基因特异性引物进行PCR扩增,分别获得大小约880 bp和430 bp的DNA片段。通过序列比对分析,16S rRNA基因片段、Aer片段序列与GenBank中登录的A.veronii ATCC35624株的的同源性均为99%。进一步试验显示该方法的敏感性较高,达到1.58×10-3ng/μL,特异性较强,只有A.veronii标准株及分离株结果呈阳性;人工模拟污染样本试验显示:该方法的检出率达到了86.7%,高于细菌分离培养的70%检出率。双重PCR检测方法的建立,为框镜鲤致病性A.veronii的检测提供新的方法。     

花斑副沙鳅源致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药物敏感性分析

为了对引起养殖花斑副沙鳅(Parabotia fasciata Dabry)幼鳅死亡的分离菌株(XQS1)进行鉴定,本研究对其进行了生理生化分析、16S rRNA基因和gyr B基因序列测定及系统进化树分析。结果显示,该致病菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)形态特征以及生理生化特性相似,通过对其16S rRNA基因和gyr B基因序列比对及进化树分析,显示该菌株与GenBank中维氏气单胞菌相关基因序列的一致性均在98%以上,而且在系统进化树中与维氏气单胞菌聚为一簇,综合以上结果确定该致病菌为维氏气单胞菌。溶血性分析和毒力基因检测结果显示,菌株XQS1能够使兔血平板呈β溶血,并携带了act、alt、aer、hlyA毒力基因,进一步证实了该菌株具有较强的致病性。药敏结果显示,该菌株对多西环素、诺氟沙星、氧氟沙星、氟苯尼考等药物敏感,而对其它药物中度敏感或耐药。本研究首次报道了维氏气单胞菌对人工养殖花斑副沙鳅的危害,并为临床上该病的防治提供了药物参考,对花斑副沙鳅产业化养殖具有重要意义。     

单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。     

捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂临床模式

本试验选用耐高温高压的菌种袋作为玉米粒培养基的培养容器,对Duddingtonia flagrans厚壁孢子进行批量培养,然后经孢子洗脱液将孢子洗脱后,将其制备成冻干制剂,并在内蒙古地区的呼和浩特市和林格尔、包头市萨拉齐、呼伦贝尔西旗等地养殖场共165头绵羊中进行了临床应用研究。通过设立不同的试验组和对照组,使用常用驱虫药伊维菌素进行驱虫试验,同时配合口服捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans厚壁孢子,在不同时间进行动物直肠采粪,对粪便进行第三期幼虫培养,然后检测比较不同组别粪便中感染性幼虫的数量,评价捕食线虫性真菌临床应用模式效果。结果显示,将伊维菌素与D.flagrans冻干制剂联合应用于绵羊的寄生性线虫病防治,可使粪便中幼虫数量降低100%,效果优于单独用药组。结果表明,捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干生物制剂与驱虫药物联合使用的临床应用模式,可以取得较好的家畜线虫病临床防控效果,值得进一步在生产实践中进行深入研究和推广。     

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。     

恩诺沙星及其代谢物在方正银鲫组织中的代谢及消除规律

近年来水产养殖中的常用药物恩诺沙星在鲫中的残留问题比较突出,但目前国家未对其在鲫中的休药期作出明确规定。为做到鲫养殖中科学合理使用恩诺沙星,在12~15℃水温条件下,以60mg/kg.b.w.剂量,对体质量为(250±10)g的健康方正银鲫(Carassius auratus gibelio)灌服恩诺沙星;在灌服后0~120d内不间断采样,用高效液相色谱-串联质谱仪检测,研究恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在方正银鲫鳃、血浆、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏中的代谢及消除规律,从而为恩诺沙星在方正银鲫中的休药期制定提供参考。结果显示:灌药后,恩诺沙星在方正银鲫血浆、肌肉、肝脏、鳃、肾脏和皮肤中的达峰时间tmax分别为9、18、24、24、48和48h,肾脏、肝脏、肌肉、血浆、鳃和皮肤中的达峰浓度cmax分别为30.490、21.372、18.715、16.636、15.157和11.663mg/kg;皮肤中的消除半衰期t1/2β最大,为338.2h,血浆中最小,为93.303h;代谢产物环丙沙星的代谢及消除趋势与恩诺沙星大致相同,血浆中达峰值产生最早,tmax为18h,肾脏中的峰浓度最大,cmax为547.26μg/kg。结果表明,方正银鲫以单次口灌60mg/kg.b.w.剂量恩诺沙星,皮肤和肌肉中的恩诺沙星和环丙沙星总量需要1200度日才能满足限量要求。本研究为恩诺沙星在鲫鱼养殖中的科学使用提供了数据支撑。     

过氧化氢对成肌细胞的氧化损伤作用研究

旨在以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,探讨氧化损伤可能的路径。本试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:对照组(Control),以DMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组(PDTC),以每个孔1 mL的PDTC(20μmol·L^-1)孵育细胞24 h;H_2O_2组(H_2O_2),加入0.5 mmol·L^-1的H_2O_2处理细胞24 h。检测各组细胞的存活率、ROS水平与凋亡率,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印记法检测细胞凋亡和自噬相关基因的表达以及NF-κB信号通路相关因子的表达。结果表明,与对照组相比,PDTC可显著提高细胞的总凋亡率(P<0.05),可显著上调细胞半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-6、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/I的值以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著下调核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)、v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)和环氧合酶(Cox)-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平(P<0.05);H_2O_2可显著提高细胞的ROS水平和细胞总凋亡率(P<0.05),可显著上调caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的mRNA表达量以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著提高Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量(P<0.05),显著下调p50、Bcl-2、RelA和Cox-1、Cox-2的mRNA表达量以及核因子kappa B(NF-κB)蛋白表达水平(P<0.05)。结果提示,H_2O_2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。     

杜仲皮水提物对虹鳟生长和肌肉品质、质构特性的影响

本试验旨在研究杜仲皮水提物对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)生长和肌肉品质、质构特性的影响。选取体质健康、平均体重(145.56±4.12) g的虹鳟450尾,随机分为5个组,每组3个重复,每个重复30尾。各组分别在基础饲料中添加浓度为0(对照组)、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的杜仲皮水提物。试验期为10周。结果表明:1)各组之间终末体重、增重率、成活率、特定生长率均无显著差异(P>0.05)。2)各组间肌肉pH45 min、pH24 h均无显著差异(P>0.05)。对照组肌肉pH下降率最高,且显著高于2.0%和4.0%组(P<0.05),0.5%和1.0%组显著高于4.0%组(P<0.05)。3)各组间肌肉离心失水率、冷冻渗出率均无显著差异(P>0.05),1.0%组肌肉滴水损失显著高于其他各组(P<0.05)。4) 4.0%组肌肉弹力和弹性显著高于对照组(P<0.05),4.0%组肌肉胶着性和咀嚼性显著高于1.0%组(P<0.05),4.0%组肌肉内聚性显著高于1.0%、2.0%和对照组(P<0.05)。5) 1.0%和4.0%组肌肉肌纤维直径显著低于对照组(P<0.05)。肌肉肌纤维密度随着杜仲皮水提物浓度的增加而增大,0.5%、1.0%、2.0%和4.0%组之间肌纤维密度无显著差异(P>0.05),但均显著高于对照组(P<0.05)。综合以上各项指标,建议饲料中添加浓度为4.0%杜仲皮水提物以改善虹鳟肌肉品质。     

合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能、肠道黏膜形态与免疫性能及结肠微生态的影响

本试验旨在研究合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能、肠道黏膜形态、空肠黏膜免疫因子含量和结肠内容物微生物组成的影响。选取72头21日龄的健康杜×长×大三元杂阉公猪,按体重分为3组,每组6个重复,每个重复4头仔猪。抗生素组饲喂添加抗生素的饲粮,试验组分别添加500(0.05%)、1 000 mg/kg(0.10%)的合生素替代抗生素。试验期为28 d,分为2个阶段(第1～14天和第15～28天)。结果表明:1)各组间不同阶段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹泻频率均没有显著差异(P>0.05),但0.05%合生素组第1～14天的平均日增重与抗生素组相比有提高的趋势(P=0.07)。2) 0.05%、0.10%合生素组空肠绒毛高度显著高于抗生素组(P<0.05);十二指肠、空肠、回肠隐窝深度各组之间无显著差异(P>0.05)。3) 0.05%、0.10%合生素组空肠黏膜中白细胞介素-4 (IL-4)的含量显著高于抗生素组(P<0.05);空肠黏膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的含量各组之间无显著差异(P>0.05)。4)与抗生素组相比,0.05%合生素组结肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著增加(P<0.05),0.10%合生素组结肠内容物中双歧杆菌的数量显著增加(P<0.05);结肠内容物中总细菌和大肠杆菌的数量各组之间无显著差异(P>0.05)。由此可见,饲粮中添加合生素替代抗生素不会降低断奶仔猪的生长性能,还可控制腹泻,提高空肠绒毛高度和免疫性能,维持肠道微生态平衡,其适宜添加量为0.05%。     

肠黏膜自然杀伤细胞的免疫功能及其调控

自然杀伤(NK)细胞是肠黏膜免疫屏障的重要组分。本文从NK细胞的发育学特征、分子表型切入,分析了其在维护肠道屏障完整性中发挥的功能,以及肠道微生物对其免疫功能的调节作用,旨在为疾病预防和肠道健康的营养调控提供理论依据。     

丝兰提取物生理功能及其在养殖生产上的应用

丝兰属是一类集观赏、食用、药用、饲料添加剂于一体的多功能植物。丝兰提取物的活性成分包含甾体皂苷、多酚类、多糖等物质,具有抗氧化、抗炎抑菌、抗肿瘤、免疫刺激活性、降糖、降低胆固醇、促进生长等多种功能。本文从丝兰提取物的主要活性成分、生理功能及其在养殖生产上的应用等方面进行阐述,深入探讨丝兰属植物在食用、药用及动物生产中可能的作用机制及潜在的应用价值。     

表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。