猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus, PCV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据ORF2基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan探针,通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线,优化反应条件,验证敏感性、特异性及重复性,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异性检测出PCV3,而对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。用构建的标准品质粒测得的灵敏度可以达到10 copies/μL,重复试验批内及批间变异系数均小于2%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏性高、特异性强的优点,可为我国PCV3型的早期检测及相关研究工作提供可靠的技术支持。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪体中的组织分布研究

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。     

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立

参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒(PRV)gH基因与猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.8℃和86.7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝/μL和180拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。     

PRRSV、PCV2与CSFV多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪瘟病毒(CSFV)3种病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了3对引物分别用于扩增PRRSV ORF7基因、PCV2ORF2基因与CSFV 5′端保守序列的部分片段。将测序正确的3段基因片段分别克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,PCV2、PRRSV与CSFV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为84.6、86.7、89.3℃,溶解曲线特异,灵敏度分别可达181、202、177拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本试验建立的PRRSV、PCV2与CSFV的荧光定量PCR检测方法实现了3种病毒的同时检测,能够对PRRSV、PCV2、CSFV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立和初步应用

为了灵敏而便捷的检测猪圆环病毒3型(PCV3),根据PCV3ORF2基因组保守序列设计合成4对引物,先使用荧光染料(SYBR)定量PCR法验证其能否有效扩增目的片段,并根据结果和引物对所扩增序列的交集进一步设计TaqMan探针,通过优化反应条件和反应体系建立快速检测PCV3的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,SYBR染料法和TaqMan探针法均能有效地扩增PCV3标准质粒以及其他阳性样品,并且对1.29×10~2~1.29×10~9拷贝·μL~(-1)的PCV3标准质粒(Pmd18-t-Cap)呈现良好的线性关系,该方法的检测灵敏度为1.29×10~2拷贝·μL~(-1),比常规PCR的灵敏度高100倍,该方法与猪圆环病毒2型、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒基因以及猪链球菌、猪肺炎支原体等细菌基因均无交叉反应,具有良好的特异性;批次内重复和批次间重复试验结果显示变异系数(CV)均小于1.5%,呈良好的可重复性。用该方法对2016年至2017年间收集的124份来自湖北省等地的猪病料DNA样品进行检测,结果显示本地区PCV3阳性率为8.06%(10/124),PCV2和PCV3共感染率为8.06%(10/124)。上述结果表明,本研究建立TaqMan荧光定量PCR能够灵敏特异的检测圆环病毒3型,为圆环病毒3型的临床检测提供有效手段。     

兽用疫苗中BVDV、PCV2和PPV污染三重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速同时检测兽用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)3种病原的方法,通过研究比对BVDV 5'-UTR、PCV2 Rep以及PPV NS1基因序列,分别设计合成了3对引物和3条荧光探针,在优化反应条件和反应程序后,建立了一种可同时检测BVDV、PCV2以及PPV的三重荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性进行了评估。结果显示,建立的三重荧光定量PCR方法灵敏度高,对3种病原核酸的最低检测限均为10 copies/μL;特异性强,与其他相关病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒)均无交叉反应。结果表明,本试验建立的三重荧光定量PCR适于疫苗中外源病毒的检测,可用于疫苗等生物制品质量把控。     

5种猪病多重PCR检测方法的建立

To establish a method for simultaneous detection of classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus (PRV), porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine parvovirus (PPV), a multiplex PCR was developed with a set of specific primers designed based on the conserved sequences of CSFV, PRRSV, PRV, PCV2 and PPV. Under the optimized conditions of multiplex PCR,five special fragments of 167 (CSFV),433 (PRRSV),305 (PRV), 559 (PCV2) and 882 bp (PPV) were amplified with a detection limit of 220, 1.6, 72, 400 and 370 pg, respectively. But the multiplex PCR amplification results of swine influenza virus （SIV）, Japanese encephalitis virus （JEV）, Streptococcus suis （SS） and porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） were negative．The results showed that the multiplex PCR method was capable of CSFV, PRV, PRRSV, PCV2, PPV infection of single or mixed clinical samples for rapid diagnosis.     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的优化

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种疱疹病毒性疾病,在世界大部分地区都是地方性家畜流行病。而且猪伪狂犬病与其他猪传染病不易区分,因此,建立一个特异性强的检测方法对于其诊断具有重要意义。实验是在实验室已经建立伪狂犬病毒单项PCR检测方法的基础上,对扩增条件进行优化后对其特异性进行了验证。结果发现,优化后的方法特异性好,只有猪伪狂犬病毒扩增为阳性,其余DNA病毒:猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)均呈现阴性。因此,本研究方法可以为今后实验室检测猪伪狂犬病毒提供参考。     

Establishment and Preliminary Application of the Multiplex PCR Method for Detection of 4 Kinds of Swine Diseases

The aim of this study was to establish a multiplex PCR method for simultaneously detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),porcine circovirus type 2 (PCV2),porcine pseudorabies virus (PRV) and Mycoplasma hyopneumoniae (Mh).Four pairs of primers were synthesized according to the reference.The multiplex PCR method was developed by optimizing the reaction condition,specificity and sensitivity detection.Four different amplicons with size of 424,490,298 and 360 bp for PRRSV,PCV2,PRV and Mh,respectively,were yielded.The sensitivity of multiplex PCR indicated that the detection limit was 3 copies by using Multiplex PCR Master Mix,and other common pathogens were not amplified.A total of 60 specimens from piglets were tested by multiplex PCR method.The positive accordance rate between simple and multiplex PCR was 100%.This study indicated that multiplex PCR might be a useful tool for rapid and sensitive etiological diagnosis and provided an effective technical support for pathogenic molecular epidemiology investigation.     

新疆地区4种猪病多重PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mh)的多重PCR检测方法。参考相关文献合成PRRSV、PCV2、PRV、Mh的特异性引物,通过对反应条件优化、特异性、敏感性测定,建立了可同时检测以上4种猪多发传染病的PCR诊断方法。扩增的片段长度分别为424 bp (PRRSV)、490 bp (PCV2)、298 bp (PRV)和360 bp (Mh),对其他常见猪病病原无特异性扩增,采用Multiplex PCR Master Mix对PRRSV、PCV2、PRV、Mh的核酸最低检出量为3个拷贝。采用多重PCR方法对60份临床样本反复检测,与单重PCR相比,4种病原符合率均为100%。结果表明,建立的多重PCR诊断方法可用于猪群中上述4种病原的单一或混合感染的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法的建立

参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒（PRV）gH基N与猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRVgH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEMTEasy载体,转化大肠杆菌DH5a,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRv荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80．8℃和86．7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝／μL和180拷贝μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。     

多重PCR结合基因芯片技术检测5种猪繁殖障碍性病毒病方法的研究

为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。     

Identification of viral pathogens in aborted fetuses and stillborn piglets from cases of swine reproductive failure in Spain

The objective of the present study was to determine the presence of recognised abortifacient viruses such as porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV), Aujeszky's disease virus (ADV), porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2), in tissues from aborted fetuses and stillborn neonates in cases of late reproductive failure in swine. A total of 293 specimens (fetuses aborted in the last third of gestation and stillborn piglets) from 100 different cases of late-term abortions and premature farrowing from 15 different Spanish provinces were studied. PRRSV was detected in 9/100 cases by RT-PCR. Only 1/100 cases analysed (corresponding to a late-term aborted fetus with a negative PRRSV RT-PCR result) was positive for PCV2 by PCR. Neither ADV (monitored by viral isolation plus antigen detection) nor PPV (monitored by ELISA antigen capture test) infection was identified. The results suggest that PRRSV is one of the most important infectious agents, if not the most relevant one, associated with fetal infection leading to abortion or premature farrowing in Spain. Moreover, other viral pathogens such as ADV, PPV and PCV2 seem to have a minor impact on reproductive disease.     

Establishment and Rudimentary Application of the nano-dPCR for Detection of PCV2 and PCV3

This study was aimed to establish a duplex nanoparticle-assisted PCR (nano-dPCR) method for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2 (PCV2) and PCV3, and to apply this method in the detection of PCV2 and PCV3. Primers specific to PCV2 and PCV3 were designed by reference to the respective gene sequences in GenBank. The reaction conditions of nano-dPCR were also optimized. An evaluation of the specificity and sensitivity of the established nano-dPCR protocol proved the method to be both specific and sensitive, with the lower detection limit for the amount of nucleic acid in PCV2 and PCV3 to be 93.2 and 91.6 copies/μL, respectively. This sensitivity was 100 times higher than that of conventional PCR. The method was applied to inspect 265 clinical samples sent for testing, and the results showed that PCV2 and PCV3 infection in pig was rather common, with 16.6% positive for PCV3, 14.7% positive for PCV2, and 6.8% for mixed infection. The detection results on clinical samples supported the newly established nano-dPCR method as a rapid and sensitive differential diagnosis for the early infection of PCV2 and PCV3.