西藏昌都两个地方绵羊品种(类群)遗传多样性分析

应用PCR和序列分析技术,分析了测定西藏昌都地区8只阿旺绵羊和8只藏绵羊mtDNA控制区全序列,并结合GeneBank中绵羊mtDNA的两种变异类型A和B序列进行了比对和系统进化分析.结果表明阿旺绵羊mtDNA控制区长度为1180～1183 bp,而藏绵羊为1 180 bp,序列中A+T含量明显高于G+C含量.将两品种(类群)9种单倍型序列与mtDNA的两种变异类型A和B序列进行比对,共发现106个变异(突变)位点,占分析位点总数的8.945%.两品种(类群)核苷酸多样性和单倍型多样性分别为1.755%、0.928%和0.857±0.082、0.893±0.086;序列的分歧度为3.8%,Kimura 2-parameter距离为0.0344.系统发育NJ树表明藏绵羊和A类线粒体聚为一类,而阿旺绵羊mtDNA单倍型序列同B型线粒体聚为一枝,说明藏系绵羊mtDNA存在一定程度的分化.     

杧果细菌性干枯病病原菌的分离与鉴定

细菌性干枯病是发生在广东杧果产区杧果上的一种新病害，为明确引起该病的病原菌种类，通过稀释涂布法分离和纯化、致病性测定、并结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对该病原菌进行鉴定。结果表明，从杧果干枯病病样中分离获得的NY01菌株，革兰氏染色呈阴性、菌体杆状。最适温度28℃，最适pH为7.0～7.2。刺伤接种到健康杧果叶片，4天后在杧果的叶片呈现典型病斑。以NY01菌株的DNA为模板，扩增获得的16S rDNA片段，经BLAST分析，NY01菌株16SrDNA序列与Sphingomonas sanguinis（登录号KT766073）的亲缘关系最近，同源性达到99.63%。经形态学、生理生化及16S rDNA序列分析将杧果细菌性干枯病病原菌NY01菌株鉴定为血红鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sanguinis），血红鞘氨醇单胞菌能够引起杧果细菌性干枯病在国内属首次报道。     

基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近，笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒（PEDV），为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行，对实验室2018-2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因（spike）分子特征研究。结果表明：腹泻样本的PEDV检出率为42.2%（49/116，95% CI=33.1%~51.8%），并获得了13条完整的S基因序列，全长为4 149~4 170 bp，序列相似性为94.2%~99.9%，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%~98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群；SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支，且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程，以贝叶斯进化分析软件包（BEAST）进行分歧时间估算，结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年，早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间（2015.7年）；SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年，早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年，所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV，并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川，为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

基于ITS分析云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的亲缘关系及分化时间

云南光叶桑、钦州长果桑在形态分类学上均属同一桑种Morus macroura。通过PCR扩增2份地方品种资源材料的ITS序列并分析序列差异及构建系统进化树,阐明各自在桑属中的遗传分化关系。2份材料的ITS序列长度均为576 bp,其中:云南光叶桑的G+C含量为59.90%,碱基序列45位A变G,560位T变G,与昆明奶桑(Morus macroura)、荥经川桑(Morus notabilis)、云南毛叶奶桑(Morus macroura var.mawa)、云南长穗桑(Morus wittiorum)、云南奶桑(Morus macroura)、雅安华桑(Morus cathayana)同在第Ⅰ类群,有较近的亲缘关系;钦州长果桑的G+C含量为59.72%,碱基序列45位为A,560位T变G,与云南华桑(Morus cathayana)同在第Ⅱ类群,有较近的亲缘关系。应用松散分子钟方法估算云南光叶桑与荥经川桑、雅安华桑、云南长穗桑的分化时间为8.23 Ma,钦州长果桑与云南华桑的分化时间为9.67 Ma,二者起源的地质年代是新第三纪中新世与上新世之交,是为了抵御地球寒冷、旱化,向南、向山地迁移形成的物种。     

西藏牦牛mtDNA ND6遗传多样性及系统进化分析

为从分子水平上探究西藏牦牛的序列多态性、遗传多态性及其系统进化关系,对西藏15个牦牛类群150个个体的mtDNA ND6基因全序列进行了测定,确定了多态位点和单倍型数目,计算了单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi),并构建了分子聚类关系图和单倍型系统发育树。结果表明:西藏牦牛mtDNA ND6基因全序列长度均为528bp,T、C、A和G 4种碱基的平均比例分别为42.2%、7.6%、20.9%、29.3%,存在一定的碱基组成偏倚性。序列变异中存在转换、颠换2种核苷酸变异类型,其中转换37次,颠换2次,表现出较强的转换偏倚性。根据序列间核苷酸变异共确定7种单倍型,其中Hap_1为西藏牦牛类群的主流单倍型,其余6种单倍型为部分类群所特有。平均单倍型多样性(Hd)、平均核苷酸多样性(Pi)分别为0.2978、0.00191,揭示西藏牦牛mtDNA ND6遗传多样性较贫乏。根据遗传距离构建了分子聚类关系图,表明西藏15个牦牛类群可分为2大类;根据7种单倍型序列构建了单倍型系统发育树,表明西藏牦牛存在2个母系起源。     

基于trnL内含子序列的桑属植物分子系统学初探

用PCR产物直接测序法对12份桑种质、1份无花果和1份构树的亮氨酸转运RNA基因(trnL)内含子序列进行了测定。trnL序列长度变异范围为534~561bp,平均核苷酸组成为0.39100(A)、0.27114(T)、0.17679(C)、0.16086(G),平均A+T含量为0.66214,说明该序列富含A/T。利用PHYLIP软件构建其最大简约数(maximum likelihood,DNAML)分子系统发育树,聚类结果表明桑属所有材料聚为一类,进一步证明桑属为单系,为探明桑属植物的亲缘关系提供了新的分子生物学证据。     

CDDP结合SRAP标记分析杧果品种的遗传多样性

摘 要：分析全球各地主要栽培的杧果品种，明确各个品种之间的亲缘关系，为杧果的培育、保护与鉴别提供科学依据。应用CDDP和SRAP分子标记技术对35个杧果品种进行遗传多样性分析，统计遗传多样性信息数据，并进行聚类分析和主成分分析。12条CDDP引物和12对SRAP引物组合分别扩增得到263条和243条条带，其中多态性条带数分别为72条和110条，多态性比率(PPB)分别为95.4545%和94.6094，有效等位基因数( Ne)分别为1.5913和1.6217，Nei''s 基因多样性(H)分别为0.3247和0.2408，Shannon信息指数(I)分别为0.55和0.46，多态性信息含量( PIC)分别为0.60和0.59，遗传相似系数变化范围分别为0.64~0.96和0.64~0.92，CDDP结合SRAP标记遗传相似系数变化范围为0.62~0.94，平均遗传相似系数分别为0.80和0.78，CDDP结合SRAP标记平均遗传相似系数为0.78，CDDP标记、SRAP标记以及CDDP结合SRAP标记分别在遗传相似系数为0.7095、0.6947以及0.6850处可以将35个杧果品种分别分为3类、3类和5类，结果表明两种标记结合分析能够更加细腻地解释杧果品种间的亲缘关系。主成分分析结果和聚类分析结果有相似之处，但也有很大不同，划分结果与杧果原产地无紧密关系。     

南江黄羊群体遗传结构分析

测定了南江黄羊4个品系(类群)14个个体进行的mtDNA控制区全序列,序列分析表明南江黄羊线粒体DNA控制区全序列长度为1,212 bp或1,213 bp,A+T含量明显高于G+C含量.其中54个核苷酸位点存在变异(约占4.5%),核苷酸多样度为1.46%±0.14%,这些差异共定义了10种单倍型,单倍型多样性为0.956±0.038.表明南江黄羊群体的遗传变异较丰富,品系(类群)间都存在不同程度的遗传分化.     

中国五个绵羊群体mtDNA D-环遗传多样性研究

为探讨中国绵羊mtDNA D-环遗传多样性,通过PCR扩增和测序技术,对中国五个绵羊群体mtDNA D-环全序列进行研究,发现这五个绵羊群体mtDNA D-环碱基组成:A、T、G、C平均含量分别为34.66%、28.94%、13.90%、22.50%,(A+T)%含量明显高于(G+C)%含量,碱基突变以转换/颠换为主,且在绵羊mtDNA D-环区存在75bp的重复序列,含有4个重复序列是中国绵羊的基本特征;遗传距离分析结果显示,甘肃滩羊与其他中国绵羊群体之间的遗传距离较大,为0.0459～0.0573,其他四个绵羊群体之间遗传距离相对较小,为0.0246～0.0342,核苷酸多样度Pi为0.0323%,说明这五个绵羊群体mtDNA D-环遗传多样性均较贫乏,应该对其遗传资源进行保护.     

青藏高原阿旺绵羊线粒体基因组研究

利用重测序方法对青藏高原阿旺绵羊线粒体基因组进行测序、组装,并对基因特点和系统发育进行分析。结果表明:阿旺绵羊线粒体基因组全长16 618 bp,该基因由13个蛋白编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因和1个非编码控制区组成;基因特点显示碱基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%,A+T含量(61.09%)比G+C含量(38.91%)高,表现出一定的碱基偏好,转换多于颠换,表现较高的转换偏向;基于线粒体基因组构建了31个不同物种的NJ树,表明阿旺绵羊与绵羊属亲缘关系最近,与牛属和岩羊属亲缘关系最远。     

DNA条形码技术在野生哺乳动物物种鉴定中的可行性

为新疆野生哺乳动物物种鉴定找出最好的方法并建立新疆哺乳动物DNA条形码数据库提供资料,本研究选取新疆野生哺乳动物的肌肉、血液、粪便作为研究材料,运用DNA条形码技术检测野生哺乳动物线粒体DNA COI基因序列。共检测片段长度为642～729 bp的52条COI基因序列,52条COI基因序列通过BLAST网站同源性比较,序列同源性达到98%～100%,相似度达到90%～99%。全部COI基因序列中A、T、C和G的平均含量为26. 3%、30. 3%、26. 0%和17. 4%,A+T的含量(56. 6%)高于C+G含量(43. 4%),有明显的碱基偏倚性。种内遗传距离为0%～2%,种间遗传距离为15%～42%,二者分离度高。邻接法和最小进化法构建的系统发育树,两种方法所得的系统进化树拓扑结构高度一致,分支明显,都分配在单个支上。说明DNA条形码技术可用于新疆野生哺乳动物物种鉴定并弥补其他物种鉴定方法的不足和缺点,在新疆濒危野生动物的管理与保护中有重要意义。     

青藏高原霍尔巴绵羊线粒体基因组研究

利用重测序方法对青藏高原霍尔巴绵羊线粒体基因组进行测序、组装,并对基因特点和系统发育进行分析。结果表明:霍尔巴绵羊线粒体基因组全长16 621 bp,该基因由13个蛋白编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因和1个非编码控制区组成;基因特点显示碱基A含量33.64%、T含量27.32%、C含量25.90%、G含量13.14%,A+T含量(61.96%)比G+C含量(39.04%)高,表现出一定的碱基偏好,转换多于颠换,表现较高的转换偏向;基于线粒体基因组构建了22个不同物种的NJ树,表明霍尔巴绵羊与绵羊属亲缘关系最近,与牛属和岩羊属亲缘关系最远。     

深县猪mtDNA CytB基因的遗传多样性与母系起源研究

为探讨深县猪群体内的遗传多样性及母系起源分化,采用PCR直接测序法测定了40头深县猪的mtDNA CytB基因长1 140 bp片段的全序列,并结合GenBank已公布的15个猪种mtDNA CytB基因全序列,采用邻接法构建深县猪、部分其他地方猪种和引进猪种的系统发育树。结果显示,在1 140 bp长的序列中A、T、G、C的含量分别为25.93%、31.72%、28.90%及13.45%,其中A+T的含量(57.65%)高于G+C的含量(42.35%);共发现2个变异位点,无插入和缺失突变,全部为转换位点,其中简约信息位点2个,未发现单一信息位点。40条序列共定义了3种单倍型,单倍型多样性(HD)为0.312,核苷酸多样性(Pi)为0.00026,平均核苷酸差异数(K)为0.327。在深县猪mtDNA CytB基因全序列NJ进化树中,三种单倍型聚为同一分支,母系来源单一,与莱芜猪、大蒲莲猪等山东品种遗传距离较近。结果表明,深县猪群体内遗传多样性比较贫乏,与山东地区的华北型黑猪种群有更近的亲缘关系。     

基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近,笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒(PEDV),为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行,对实验室2018—2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因(spike)分子特征研究。结果表明:腹泻样本的PEDV检出率为42.2%(49/116,95%CI=33.1%～51.8%),并获得了13条完整的S基因序列,全长为4 149～4 170bp,序列相似性为94.2%～99.9%,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%～98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群;SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支,且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程,以贝叶斯进化分析软件包(BEAST)进行分歧时间估算,结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年,早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间(2015.7年);SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年,早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年,所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV,并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川,为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

藏系绵羊、新疆细毛羊及阿勒泰羊mtDNA D-loop基因序列分析及系统进化研究简

为研究藏系绵羊的贾洛、红原、欧拉3个类群与新疆细毛羊、阿勒泰羊的遗传多样性及系统进化关系,试验对该5个类群89个绵羊个体的mtDNA D-loop区全序列进行测序分析。结果显示,该5个绵羊类群89个个体总共发现有168个多态性位点,单一多态位点（singleton variable sites） 82个,简约信息位点（parsimony informative sites）86个,碱基A+T的平均含量达到了62.5%,明显高于C+G（37.5%）,共检测到70种单倍型,核苷酸多样性（Pi）在0.01040～0.02892之间,单倍型多样性在0.640～1.000之间,平均核苷酸差异数（K）为18.340,Tajima’s D中性检验发现这5个类群均不显著。通过构建NJ进化树结果表明,在藏系绵羊中红原类群与欧拉类群的亲缘关系最近,其次藏系绵羊中贾洛类群才与红原、欧拉类群聚为一类,再依次聚类的为新疆细毛羊、欧洲摩弗伦羊、东方盘羊;盘羊与羱羊单独聚为一类。该5个类群存在明显的3个母系起源。     

坝上长尾鸡线粒体DNA D-loop序列变异与起源分化研究

为了更好地保护和利用坝上长尾鸡的品种资源,且从母系遗传的角度探明坝上长尾鸡的遗传多样性与起源分化,试验采用PCR直接测序法,测定了30只坝上长尾鸡线粒体DNA(mt DNA)D-loop区1 491bp片段序列。结果显示:在所测定的mt DNA D-loop序列中,A、G、T和C碱基的平均含量分别为28.02%、13.91%、30.97%、27.10%。共检测到1个插入/缺失和32个变异位点,组成17个单倍型。单倍型多样度为0.945±0.025,群体内序列间核苷酸平均差异数为8.536,核苷酸多样度为0.00573,平均遗传距离为0.006。由最大似然法构建的NJ系统进化树将坝上长尾鸡聚为3大支,划分为与A、B、C 3个类群。与其它家鸡品种类比,显示其独特性。与原鸡亚种类比,发现A类群起源于原鸡海南亚种,B类群起源于原鸡印度亚种,C类群起源于原鸡滇南亚种。结果表明:坝上长尾鸡遗传多样性丰富,并具有独特性;坝上长尾鸡存在3个区分明显的母系来源。     

四川7个地方山羊品种(类群)mtDNA遗传多样性研究

测定了四川7个地方山羊品种（类群）43个个体的mtDNA控制区全序列，结果表明：山羊mtDNA控制区全序列长度为1212bp或1213bp，A＋T含量（59．9％）明显高于G＋c含量（40．1％）。共检测到74个变异位点，序列均为中性突变，核苷酸多样度为1．686％，这些差异共定义了27种单倍型，单倍型多样度为0．966，遗传多样性较为丰富，品种（类群）间存在不同程度的遗传分化。7个地方山羊品种（类群）间的遗传距离变异范围为0．0017～0．0306。用MEGA软件的NJ法构建单倍型序列的系统发育无根树，结果表明四川地方山羊品种（类群）有两个母系来源，但是否就对应于角笋骨羊（Capra aegagrus）和捻角山羊（Capra falconeri）两个野生祖先，还有待于进一步研究。     

兴义矮脚鸡GH基因的多态性研究

兴义矮脚鸡为贵州特有的地方品种鸡.本研究对兴义矮脚鸡GH基因上第一外显子和部分第一内含子序列直接测序进行多态性分析.结果表明,在扩增出来的777 bp序列中,A、T、G、C碱基的平均含量分别为28.1%、23.9%、24.9%和23.1%.A+T的含量(52%)略高于G+C的含量(48%);总共发现10个变异位点,占分析位点总数的1.287%,这些变异位点分别为C124T、T319G、T321C、G333A、A364G、A464C、A507C、C508A、T541C和T630C,其中C124T突变点位于5'端调控区,其余突变点都集中在第一内含子上,均为转换,表现较高的转换偏向.     

兴义矮脚鸡GH基因的多态性研究

兴义矮脚鸡为贵州特有的地方品种鸡。本研究对兴义矮脚鸡GH基因上第一外显子和部分第一内含子序列直接测序进行多态性分析。结果表明,在扩增出来的777 bp序列中,A、T、G、C碱基的平均含量分别为28.1%、23.9%、24.9%和23.1%。A+T的含量(52%)略高于G+C的含量(48%);总共发现10个变异位点,占分析位点总数的1.287%,这些变异位点分别为C124T、T319G、T321C、G333A、A364G、A464C、A507C、C508A、T541C和T630C,其中C124T突变点位于5′端调控区,其余突变点都集中在第一内含子上,均为转换,表现较高的转换偏向。     

家兔线粒体ATPase6,8基因的遗传分析

测定了4个地方品种、7个培育品系和10个引进品种共124只家兔的线粒体ATPase6,8基因801bp序列。结果表明:124只家兔ATPase6,8基因的A、G、T、C4种碱基的含量分别为30.46%、10.74%、29.34%和29.46%,A+T含量(59.8%)明显高于G+C(40.2%);发现了9个变异位点,其中转换7个,颠换2个,没有发现缺失或插入,变异多发生在密码子的第3位,核苷酸多样度为0.0004,说明家兔线粒体DNA遗传差异较小;确定了5种单倍型,单倍型多样度为0.121,单倍型H5为所有品种的共享单倍型,大多数个体属此单倍型,这可能与家兔的连续定向选育有关,用邻接法构建的家兔分子系统发育树表明我国家兔起源于2个母系。