基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近,笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒(PEDV),为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行,对实验室2018—2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因(spike)分子特征研究。结果表明:腹泻样本的PEDV检出率为42.2%(49/116,95%CI=33.1%～51.8%),并获得了13条完整的S基因序列,全长为4 149～4 170bp,序列相似性为94.2%～99.9%,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%～98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群;SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支,且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程,以贝叶斯进化分析软件包(BEAST)进行分歧时间估算,结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年,早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间(2015.7年);SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年,早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年,所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV,并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川,为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

中国西南部分地区2020－2021年猪流行性腹泻病毒遗传变异分析

【目的】 了解中国西南部分地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因型及遗传变异规律。【方法】 对2020－2021年四川和云南不同地区来源的200份腹泻猪肛门拭子进行RT-PCR检测,对PEDV S和ORF3基因进行克隆测序,利用MegAlign软件进行变异性分析,采用Mega 7.0软件进行系统进化分析,采用RDP4软件进行基因重组分析。【结果】 在所有样本中PEDV总体阳性率为15.50%（31/200）,群体阳性率为100%（8/8）。检出的8株PEDV S基因和ORF3基因序列与已登录毒株相似性分别为90.5%~99.4%和92.9%~100%。对S基因的进化分析显示,8个PEDV流行株分布于G2a、G2b和G2c 3个亚群中。其中,四川SCWJSWUN02株与福建CH/FJXM/1/2012株遗传距离较近,云南YNKMSWUN01株与越南毒株单独聚为一支,表明当前西南地区PEDV的流行呈现出区域间传播的特征。与本地区近年流行毒株和常用疫苗株相比,其S蛋白氨基酸序列均存在不同程度的变异,但ORF3蛋白相对保守。部分毒株S蛋白存在连续氨基酸的插入或缺失,如在SCMYSWUN03株S蛋白59－62位氨基酸处发现4个氨基酸的缺失;在YNKMSWUN01株78－82位氨基酸处和84－88位氨基酸处分别有5个氨基酸插入和缺失。部分氨基酸突变位点存在于已鉴定的PEDV S蛋白受体结合中。此外,基因重组分析结果显示,SCMYSWUN03株可能发生了基因重组事件,概率为98.2%（P<0.01）。【结论】 本研究发现当前西南地区流行的PEDV毒株包括G2a、G2b和G2c 3个亚群,毒株基因型具有多样性,且不同毒株间的变异性较大,丰富了PEDV在四川和云南地区的分子流行病学调查资料,揭示了中国西南地区流行的8个PEDV毒株的分子遗传变异规律和进化特征,为本地区猪腹泻病防控措施的制定提供了理论依据。     

猪流行性腹泻病毒HB/HEBEU/2020株全基因组遗传变异与重组分析

【目的】了解猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的基因组特征及变异规律。【方法】以3只发病仔猪小肠病料作为模板,采用RT-PCR技术检测病原。以检测阳性的肝脏组织RNA为模板,进行RT-PCR,分段扩增PEDV全基因组,使用DNAStar软件对PEDV基因组测序结果进行剪辑、拼接和相似性分析,利用Mega X 10.0.5软件对PEDV基因组和S基因进行遗传进化分析;利用RDP4软件对PEDV基因组进行重组分析。【结果】PCR检测结果表明,3只病仔猪的小肠组织均检测到PEDV阳性。采用RT-PCR分段扩增成功获得1株PEDV全基因组序列,命名为HB/HEBEU/2020株,基因组大小为28 038 bp,含有7个开放阅读框,从5'到3'依次为复制酶1a基因、复制酶1b基因、S基因、ORF3基因、E基因、M基因和N基因。相似性分析结果显示,HB/HEBEU/2020与SNJ-P、USA/Colorado/2013和HB2018等变异毒株全基因组和S基因的相似性均较高,分别为97.8%~99.3%和95.7%~98.8%,在所有市售疫苗株中,与变异型疫苗株AJ1102毒株全基因组和S基因的相似性分别为98.3%和97.3%;遗传进化分析结果显示,21株PEDV可划分为G1群和G2群2个分支,G1群进一步分化为G1a亚群和G1b亚群,G2群进一步分化为G2a亚群和G2b亚群,HB/HEBEU/2020属于G2a亚群。在G2群内,所有流行株均为2010年后出现,HB/HEBEU/2020与市售疫苗株AJ1102遗传距离较近,其次是LW/L,与CV777和attenuated CV777株遗传距离较远;经重组分析,HB/HEBEU/2020基因组可能为重组毒株,存在3个潜在的重组事件,重组事件1~3的断点分别为15 918—22 119、100—734和2 214—2 729 bp,其中重组事件1和2发生概率较大。【结论】HB/HEBEU/2020为1株变异型PEDV,与以CV777为代表的经典毒株亲缘关系较远,与2010年后中国发生的变异型毒株亲缘性较近,并且存在潜在重组事件。本研究结果可为调研中国当前PEDV进化和变异提供重要资料,为遏制PEDV蔓延与进化、制定合理防控方案提供理论和现实依据。     

四川彭州猪流行性腹泻流行株全基因序列测定及其遗传变异分析

为了对四川省彭州某免疫过猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗猪场猪感染的PEDV毒株基因组特征和遗传变异规律进行研究,本试验采用RT-PCR法筛选PEDV阳性样本,命名为SCXM株,对全基因组序列克隆测序获取全基因组序列,并对主要结构基因进行遗传变异分析和系统进化分析。结果显示,SCXM株的遗传变异主要集中在S基因,与71个毒株相比同源性为90.4%~99.2%,与猪场免疫疫苗株CV777相比同源性仅为93.8%。与国内常用疫苗毒株相比,在5个线性抗原表位（P1、S1P2、S1P3、SS5和SS6）和1个中和抗原表位（SID）均存在氨基酸位点突变。遗传进化分析表明,SCXM株属于G2b亚型PEDV,与湖北HBXY3株和越南毒株同在一个分支,表明这些地区流行毒株的演化过程存在相关性。另外对ORF3、M和N基因分析结果显示,SCXM与疫苗株相比均存在一定数量的氨基酸突变,但变异程度相对较小,且未引起抗原性预测值的变化。结果表明,PEDV SCXM株属新型变异毒株,其S基因发生较大程度的变异,S基因多个氨基酸突变和抗原性的变化可能是导致猪场疫苗免疫失败的原因之一。本研究丰富了PEDV基因学研究资料,探讨了SCXM株PEDV遗传变异和演化特征,为PEDV的分子演化研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒变异株的鉴定和分子特征分析

为查明山东省某猪场流行性腹泻的病因,本研究对该猪场病死仔猪进行病理学检查,并对采集的7份仔猪腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)的套式RT-PCR检测。病理学检查发现病猪的肠道肿胀、变薄、出血,肠绒毛皱缩、变短、边缘粗糙。套式RT-PCR结果显示,7份样品均为PEDV阳性;对其中两份PEDV阳性病料进行S基因扩增,分析其遗传变异,结果显示这两株PEDV野毒株的S基因与参考疫苗株CV777的同源性为92.3%~92.4%,与其他野毒株的同源性为96.6%~98.6%。PEDV的遗传进化树结果显示,PEDV分为两个进化分支G1和G2,G1包括CV777等疫苗株及中国和韩国早期的部分毒株,G2则是PEDV变异株为主的分支,包括本试验分离的野毒株及近年来美国、中国等国的野毒株,这些毒株都存在两个插入突变和1个缺失突变。结果表明,变异株已成为PEDV的流行优势毒株,且这些变异位点有可能成为鉴定PEDV变异株的分子特征。     

利用宏基因组学鉴定藏猪腹泻粪便病毒种群

为进一步了解藏猪腹泻粪便中病毒种群，从青藏高原地区16个藏猪场采集腹泻粪便样本146份，将样本混合成一个pool样，提取RNA反转录成cDNA，建库后利用TruSeq Illumina测序，对测序的序列进行整理分析及相关病毒的分子特征进行研究。数据分析结果表明：藏猪腹泻粪便样本病毒种群包括11个病毒科的19种病毒，主要以线性和环状的小DNA病毒为主，如猪粪相关环状病毒7型、猪腺病毒和猪博卡病毒（PBoV）等；与腹泻相关的病原有猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）和牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）3种；与腹泻相关的新发病原有porcine bufavirus、rabovirus和pasivirus 3种。利用SOAP软件组装出猪细小病毒6型（PPV-6）、PCV-2、PBoV-2完整或接近全长的基因组和戊型肝炎病毒（HEV）完整的ORF2基因序列，系统发育结果显示PPV-6和PCV-2与参考毒株有较近的遗传进化关系，PBoV-2与参考毒株有较远的遗传进化关系，单独聚为一簇，可能是一个全新的基因型。为进一步调查PCV-2在藏猪腹泻粪便中的检出率，对采集146份样本进行检测，检出率为10.96%（16/146，95% CI：6.4%~17.2%），且与四川地区PCV-2流行株有较近的亲缘关系。本研究发现藏猪腹泻粪便中病毒种类复杂多样，且可能存在与其他动物和人交叉感染情况，具有重要的公共卫生学意义，也为藏猪腹泻病防控提供一定的理论依据。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒（PEDV）的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示：该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）及传染型胃肠炎病毒（TGEV）等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×10¹拷贝·μL^-1,比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%～99.1%;氨基酸的相似性为94.6%～98.7%。结果表明：本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。     

贵州省猪流行性腹泻病毒ORF3、M基因克隆及序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3及M基因的遗传变异情况,试验于2014年4月－2015年3月从贵州省5个地区采集105份腹泻仔猪的粪便,应用RT-PCR方法进行PEDV检测,从中选择8份PEDV阳性样本,扩增其ORF3及M基因,测序并进行序列比对分析.结果显示,从采集的105份粪便样本中可检出75份PEDV阳性样本,阳性率为71.43%;8株PEDV贵州株ORF3及M基因序列均无碱基缺失或插入;ORF3基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在95.1%~100.0%与95.1%~99.6%之间,M基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.4%~100.0%与98.7%~100.0%之间;氨基酸系统进化树分析结果显示,2014~2015年贵州流行株与近年来中国毒株、韩国毒株及泰国毒株亲缘关系较近,与疫苗株Attenuated DR13及CV777株亲缘关系较远.提示目前贵州省仔猪腹泻病原主要是PEDV,且为PEDV强毒株.     

藏猪源捷申病毒的检测和遗传演化分析

旨在调查四川地区藏猪捷申病毒（porcine teschovirus,PTV）的流行及分子特征和遗传演化。用RT-PCR法对2017-2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市14个藏猪场96份粪便样品进行检测,并对全基因组进行序列分析和基因分型。PCR检测结果表明,PTV核酸阳性率为20.8%（20/96,95% CI=13.2%~30.3%）,14个规模藏猪场中PTV猪场阳性率为57.1%（8/14,95% CI=28.9%~82.3%）,并从2份阳性样本中获得了2条近似全长的PTV全基因组序列,分别命名为SWU-E5-2018和SWU-ZG2-2018,核苷酸序列相似性为83.1%。通过VP1序列分析发现2条序列的血清型分别为3型和6型。通过基因重组分析发现SWU-E5-2018存在重组现象,重组区域位于衣壳蛋白基因P1的552-3 082 nt处。为了进一步研究2条PTV序列的演化过程,以贝叶斯进化分析软件进行分歧时间估算,结果表明,SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年,SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。本研究首次对藏猪源PTV进行了初步调查,结果表明藏猪中存在一定程度的PTV感染,为深入研究藏猪源PTV遗传变异及其生物学特性提供了参考依据。     

粤北地区新生仔猪腹泻病原学调查及PEDV ORF3基因分子特征和遗传变异分析

为了解粤北地区新生仔猪腹泻病的主要病原,本试验采用实时荧光定量RT-PCR方法对2015年粤北地区6个规模化猪场31份新生仔猪腹泻样品进行了猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)检测,并对5株PEDV流行毒株ORF3基因进行测序分析。病原检测结果显示,83.87%(26/31)样品为PEDV阳性,没有检测到TGEV和PoRV阳性样品。对PEDV ORF3基因序列分析结果显示,5个流行毒株ORF3基因全长均为675bp,相互之间核苷酸同源性为98.7%~100.0%,与参考序列同源性为94.5%~100.0%,多个核苷酸位点发生了共同突变。系统进化树分析结果表明,PEDV可分为两个基因群,粤北地区流行的PEDV与2013-2015年间在中国部分地区、东南亚、北美洲和欧洲流行的PEDV遗传关系较近,位于基因1群中的同一个亚群,而2011-2012年中国流行的PEDV主要毒株及疫苗毒株则归类于另外两个基因亚群。结果表明,粤北地区新生仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,PEDV基因随着时间推移呈现不断进化和变异趋势。     

四川地区藏猪戊型肝炎病毒的检测和遗传演化分析

旨在调查四川地区藏猪戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）的流行情况和遗传演化,作者用RT-PCR法对2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿坝藏族自治州的22个藏猪场332份藏猪粪便样本进行HEV检测,并对阳性样本进行基因分型。RT-PCR检测结果表明HEV核酸阳性率为20.48%（68/332,95% CI=16.3%~25.2%）,22个规模藏猪场中HEV猪场阳性率为77.27%（17/22,95% CI=54.6%~92.2%）,健康样本阳性率为2.86%（3/105,95% CI=0.6%~8.1%）,腹泻样本阳性率为28.63%（65/227,95% CI=22.8%~35.0%）,系统进化分析显示所有阳性株均为G4型。为了进一步研究该地区流行毒株的演化过程,以贝叶斯进化分析软件进行分歧时间估算,结果表明,藏猪流行毒株的分歧时间最早为1999年,最晚为2016年。并分别从每年的样本中挑选1份阳性样本得到全基因组序列,核酸序列相似性为89.5%~93.1%。通过对3条全基因组重组分析发现SWU/301/2019存在重组现象,SWU/301/2019重组区域位于ORF1的3 746—4 655 bp。本研究首次对四川地区藏猪源HEV进行调查,结果表明四川藏猪中存在一定程度的HEV感染,为四川地区对藏猪感染HEV的防治以及深入研究四川藏猪源HEV遗传变异及生物学特性提供了参考依据。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪“顽固性腹泻”疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析.结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7％～100.0％,氨基酸的同源性为94.7％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7％,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0％.M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8％～100.0％,氨基酸的同源性为94.8％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8％,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0％.4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远.     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】 探索猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】 以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a （+）原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验（IFA）检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】 成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒;PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16 ℃诱导8 h条件下可获得最高表达量,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,PEDV-S重组蛋白成功表达;ELISA检测结果显示,制备的多克隆抗体效价达1：3 280 500;IFA结果显示,多克隆抗体有良好的特异性,可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】 本研究获得了PEDV-S重组蛋白,并成功表达S1蛋白,制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。