PPARγ对猪血管内皮细胞增殖、迁移及小管形成的影响

试验旨在研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ,PPARγ)对猪血管内皮细胞增殖、迁移及小管形成的影响,并探讨PPARγ在猪体外血管生成中的作用。设置PPARγ激动剂组(5、10、15、20μmol/L罗格列酮)、抑制剂组(5、10、15、20μmol/L T0070907)及对照组,通过iCelligence细胞功能分析、划痕试验和Matrigel基质胶三维培养,构建猪体外血管生成的模型,模拟猪体内血管生成的环境,分别对猪血管内皮细胞的增殖、迁移、小管形成能力进行测定,同时根据NCBI已有的相关序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PPARγ基因特异性引物,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测PPARγ基因mRNA相对表达量,对PPARγ的体外作用效果进行验证。结果显示,5、10μmol/L罗格列酮能促进猪血管内皮细胞增殖、迁移及小管形成,T0070907的抑制效果在试验浓度区间内(5~15μmol/L)随浓度升高而加强,较高浓度(20μmol/L)的两种药物均由于药物毒性的影响对细胞活动产生干扰。此外,5~20μmol/L罗格列酮和5~20μmol/L T0070907能分别提高和降低PPARγ基因mRNA相对表达量,且浓度趋势与增殖、迁移、小管形成的试验结果一致。综上所述,通过激活PPARγ可以对猪血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成产生促进效果,提示其在猪体外血管生成中具有积极作用,可为研究PPARγ对猪胎盘血管发生的影响提供参考依据。     

转录因子互作调控鸡脂肪细胞分化研究

哺乳动物的CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、CAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)和胆固醇调节元件结合蛋白质1(SREBP1)是脂肪细胞分化调控的重要因子,鸟类脂肪细胞分化的分子调控网络目前还不清楚。本研究利用荧光素酶报告基因检测发现,C/EBPα、C/EBPβ和SREBP1过表达促进鸡PPARγ基因启动子活性(P0.05);C/EBPβ和SREBP1过表达抑制鸡C/EBPα基因启动子活性(P0.05);PPARγ过表达促进鸡FAS基因启动子的活性(P0.05),并抑制鸡LPL和AFABP基因启动子活性(P0.05),但对鸡C/EBPα基因启动子活性没有显著影响(P0.05)。本研究结果为进一步阐明鸡脂肪细胞分化的转录调控网络奠定了基础。     

染料木黄酮对3T3-L1细胞增殖与分化的影响

试验旨在研究染料木黄酮对3T3-L1细胞增殖与分化的影响以及对分化过程中相关基因表达的影响。以浓度为0、10、50、100、200μmol/L的染料木黄酮处理细胞,测定不同天数3T3-L1细胞相对增殖量、细胞合成脂肪量以及第8天与脂肪合成有关的基因PPARγ、FASN、LPL、ACC、HSL的相对表达量。结果表明：在增殖方面,染料木黄酮能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖（P〈0.05）。随着染料木黄酮浓度的增加,细胞增殖的抑制作用越强。当浓度为200μmol/L时,细胞停止增殖。在分化方面,染料木黄酮能显著减少3T3-L1前脂肪细胞分化合成脂肪的量（P〈0.05）。随着染料木黄酮浓度的增加,细胞分化合成脂肪量减少。染料木黄酮能显著减少3T3-L1细胞与脂肪合成有关的基因PPARγ、FASN、LPL、ACC、HSL的相对表达量（P〈0.05）。在浓度为50μmol/L时,PPARγ基因相对表达量最低;在浓度为200μmol/L时,FASN基因相对表达量最低;在浓度为10μmol/L时,LPL基因相对表达量最低;在浓度为200μmol/L时,ACC基因相对表达量最低;在浓度为10μmol/L时,HSL基因相对表达量最低。分析推测,染料木黄酮通过抑制与脂肪合成相关基因的表达来减少脂肪合成量。     

鸡IFN-β启动子荧光素酶报告载体的构建与活性检测

构建并鉴定鸡β干扰素(IFN-β)基因启动子荧光素酶报告基因载体并进行转录活性分析.通过PCR方法从鸡基因组DNA中克隆鸡IFN-β基因启动子,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-basic载体上,构建鸡IFN-β基因启动子荧光素酶报告基因载体pChIFN-β-luc;用脂质体法将构建的报告基因载体瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,并设置空白对照组和poly(I:C)处理组,检测荧光素酶的活性.经PCR扩增出鸡IFN-β基因启动子序列,双酶切及测序鉴定各重组体构建正确;转染后检测,pChIFN-β-luc具有转录活性,并且在poly(I:C)的刺激下其荧光素酶活性显著升高.本试验为进一步研究鸡IFN-β基因转录调控机制奠定了基础.     

5-Azadc和TSA对鸡Nanog基因启动活性及ESC多能性维持的影响

旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据。PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对Nanog基因启动子活性的影响。选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5-Azadc+TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高Nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性。     

鸡Perilipin1基因启动子的克隆及分析

旨在研究鸡脂滴包被蛋白基因(Perilipin1,Plin)启动子的结构及特征。本研究采用PCR方法扩增了鸡Perilipin1基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,并对其进行了克隆、测序及生物信息学分析;同时,构建了其全长及系列截短突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1),用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性,确定了该基因的核心启动子区域。生物信息学分析结果表明,鸡Perilipin1基因的启动子区不存在典型的TATA box结构和CpG岛,但可能存在TFIID、Sp1、AP2、PPAR、RXR、SREBP1、C/EBP、GATA、ER、KLF5等多个转录因子结合位点;报告基因分析结果表明,本研究克隆的鸡Perilipin1基因启动子能够极显著地启动报告基因的表达(P0.01),并且随着启动子片段由5′端逐渐截短,报告基因活性表现出逐渐增强的趋势,其中-360/-11片段具有最强的报告基因活性。综上表明,鸡Perilipin1基因-360/-11区域的启动子片段具有最强的转录活性,包含该基因的核心启动子序列。     

全反式视黄酸对3T3-L1前脂肪细胞分化及PPARγ和C/EBPα mRNA表达的影响

本研究旨在探讨全反式视黄酸(all trans retinoic acid,ATRA)对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其机制。培养3T3-L1前脂肪细胞,分别设置对照组以及10-9、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L ATRA的处理组,油红O染色观察3T3-L1前脂肪细胞分化的形态变化;油红O染色提取法分析不同浓度ATRA对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响;Real-time PCR技术检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA水平的表达。结果表明:10-7、10-6和10-5 mol/L的ATRA抑制3T3-L1前体脂肪细胞的分化(P0.01),而10-9和10-8 mol/L的ATRA对3T3-L1前体脂肪细胞分化没有显著影响(P0.05)。10-5 mol/L的ATRA处理的前脂肪细胞,分化相关基因PPARγ和C/EBPαmRNA的表达减少,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.01)。结果显示,高浓度的ATRA可以抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,减少脂肪细胞分化过程中脂质的堆积,机制可能与其抑制脂肪细胞分化相关基因PPARγ和C/EBPαmRNA表达有关。     

玉米赤霉烯酮对大鼠原代睾丸支持细胞脂质合成的影响

为揭示玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)的雄性生殖毒性及其机理，本试验研究了ZEA对大鼠睾丸支持细胞(sertoli cells, SCs)脂质合成的影响。选用大鼠原代SCs作为材料，设置对照组(无ZEA组)、染毒组(不同浓度ZEA处理组),处理24 h后，CCK-8法检测细胞活性，甘油三酯(TG)试剂盒检测TG含量，尼罗红染色检测细胞内脂滴含量，蛋白免疫印迹检测脂肪酸合成蛋白的表达，ATP试剂盒检测细胞内ATP含量。结果显示，染毒组与对照组相比，ZEA浓度为20,30μmol/L时，大鼠SCs活性呈极显著下降趋势；10,20μmol/L ZEA可促使SCs内TG含量的极显著上升(P<0.01),且呈剂量依赖性关系；20μmol/L ZEA可促使SCs内脂滴含量的极显著性上升(P<0.01);各ZEA染毒组的脂质合成相关蛋白PPARγ和SREBP1的表达呈现极显著性上升(P<0.01),FAS呈现上升趋势但无显著性(P>0.05);10,20μmol/L ZEA组ATP呈现极显著性下降(P<0.01)。结果表明，ZEA对大鼠SCs具有一定的毒...     

油酸和亚油酸对山羊乳腺细胞甘油三酯含量及乳脂合成相关基因表达的影响

为探讨外源添加油酸和亚油酸对体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯(TG)含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响,试验以奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,分别用0、50、100、200μmol/L油酸和0、20、40、80μmol/L的亚油酸处理细胞24h,检测细胞内TG的含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞内乳脂合成相关基因mRNA水平的变化。结果显示,100、200μmol/L的油酸和40、80μmol/L亚油酸均显著促进细胞内TG的合成(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,添加100、200μmol/L油酸可显著上调二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)及脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达(P<0.05),显著抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因的表达(P<0.05),而对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因的表达无显著影响(P>0.05)。添加20μmol/L亚油酸可显著抑制ACC和FASN基因的表达(P<0.05);亚油酸浓度为40和80μmol/L时可显著上调DGAT2基因的表达(P<0.05),抑制SCD1和SREBP1基因的表达(P<0.05),对ACC、FASN和PPARγ基因表达均无显著影响(P>0.05)。综上所述,100～200μmol/L油酸和40～80μmol/L亚油酸对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂肪合成具有较好的促进效果。     

桑叶中对PPARγ有激活作用的组分分离和活性鉴定

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)是调节脂肪细胞基因表达和分化的重要因子,也称作胰岛素增敏剂受体,一些脂肪酸对PPARγ有激活作用。桑叶中含有多种脂肪酸,以其为材料,利用构建的COS-7细胞高通量筛选模型筛选具有PPARγ配体活性的组分及单体。桑叶粉通过正己烷提取和石油醚萃取后,石油醚萃取组分(Fr.P)对PPARγ的激活倍数可达到阴性对照DMSO的3.34倍。经气相色谱-质谱(GC-MS)分析,从桑叶正己烷提取物(Fr.H)和Fr.P组分中共获得19种脂肪酸,其中Fr.H中的亚麻酸质量分数为1.91%,亚油酸为0.94%,十四酸为0.11%。高通量细胞筛选模型分析显示,与阴性对照DMSO比较,100μmol/L十四酸对PPARγ的激活倍数为1.51,50μmol/L十五酸对PPARγ的激活倍数为2.12,150μmol/L亚麻酸对PPARγ的激活倍数为2.48,100μmol/L亚油酸对PPARγ的激活倍数为2.21,而其他脂肪酸均无PPARγ配体活性。通过十四酸、亚麻酸和亚油酸的协同PPARγ激活效应分析,推测桑叶中可能含有非脂肪酸的PPARγ激动剂成分。研究结果提示有望从桑叶中寻找到新的天然胰岛素增敏剂。     

油酸和亚油酸对山羊乳腺细胞甘油三酯含量及乳脂合成相关基因表达的影响

为探讨外源添加油酸和亚油酸对体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯(TG)含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响,试验以奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,分别用0、50、100、200μmol/L油酸和0、20、40、80μmol/L的亚油酸处理细胞24h,检测细胞内TG的含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞内乳脂合成相关基因mRNA水平的变化。结果显示,100、200μmol/L的油酸和40、80μmol/L亚油酸均显著促进细胞内TG的合成(P0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,添加100、200μmol/L油酸可显著上调二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)及脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达(P0.05),显著抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因的表达(P0.05),而对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因的表达无显著影响(P0.05)。添加20μmol/L亚油酸可显著抑制ACC和FASN基因的表达(P0.05);亚油酸浓度为40和80μmol/L时可显著上调DGAT2基因的表达(P0.05),抑制SCD1和SREBP1基因的表达(P0.05),对ACC、FASN和PPARγ基因表达均无显著影响(P0.05)。综上所述,100～200μmol/L油酸和40～80μmol/L亚油酸对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂肪合成具有较好的促进效果。     

葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的影响

为探究葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的调控作用,在细胞诱导液中分别添加0、10、20、40、60和80 μmol/L葛根素进行成脂诱导分化,用油红O染色法和甘油三酯酶法检测脂肪细胞分化过程中脂滴聚集情况和甘油三酯含量以考察脂质沉积和分化效果,并确定葛根素的最佳添加浓度;用实时荧光定量PCR检测对照组(0 μmol/L)和最佳葛根素浓度添加组成脂标志基因细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)及成脂分化基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸结合蛋白(FABP4)、应激蛋白(TRIB)和叉头框蛋白O1 (FOXO1)的mRNA的表达水平,用Western blotting检测PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平。结果表明,与对照组相比,20、40和60 μmol/L葛根素均显著增加脂滴和甘油三酯含量(P<0.05),且40 μmol/L葛根素效果最佳;实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著上调成脂标志基因PPARγ、C/EBPα及成脂分化基因ACC、FABP4、FOXO1和TRIB的表达(P<0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著增加PPARγ蛋白表达(P<0.05)。综上所述,40 μmol/L葛根素能够促进松辽黑猪前体脂肪细胞的成脂分化和脂质沉积。     

基于AMPK通路研究葛根素对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响

【目的】 探究葛根素是否通过AMPK通路促进松辽黑猪前体脂肪细胞分化,以期为在饲粮中添加葛根素改善猪肉肉质提供参考。【方法】 待松辽黑猪前体脂肪细胞汇合度达90%时进行为期4 d的诱导分化。诱导分化时,将细胞分为对照组（Con）、葛根素组（Pue）、葛根素+AMPK激活剂AICAR组（AICAR）及葛根素+AMPK抑制剂CompoundC组（CompoundC）,对照组诱导液中不添加葛根素,Pue组添加40 μmol/L葛根素,AICAR组添加40 μmol/L葛根素+500 μmol/L AICAR,CompoundC组添加40 μmol/L葛根素+20 μmol/L CompoundC。诱导分化结束,收集各组细胞,用甘油三酯（TG）酶法检测细胞中甘油三酯浓度;实时荧光定量PCR检测AMPK各亚基以及成脂分化相关基因的表达水平;用Western blotting检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK （Thr-172）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的蛋白表达水平;通过Autodock Vina 1.20对葛根素、AMPKα亚基做分子对接预测。【结果】 甘油三酯测定结果显示,与Con组相比,Pue组甘油三酯浓度显著增加（P<0.05）;与Pue组相比,AICAR组甘油三酯浓度显著降低（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,与Con组相比,Pue组PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1、PGC-1α表达量均显著降低（P<0.05）,Pue组C/EBPα、PPARγ、ACC表达量均显著增加（P<0.05）;与Pue组相比,AICAR组PPKAG1、PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1表达量显著增加（P<0.05）,AICAR组C/EBPα、PPARγ、ACC表达量均显著降低（P<0.05）,CompoundC组PPKAG1、PPKAG2、PPKAB2表达量均显著降低（P<0.05）,CompoundC组C/EBPα、ACC表达量均显著增加（P<0.05）。Western blotting结果显示,与Con组相比,Pue组PPARγ、ACC蛋白表达量显著增加（P<0.05）,AMPK、p-AMPK蛋白表达量显著下降（P<0.05）,且p-AMPK/AMPK显著下降（P<0.05）;与Pue组相比,AICAR组PPARγ、ACC蛋白表达量显著下降（P<0.05）,AMPK、p-AMPK蛋白表达量显著增加（P<0.05）,CompoundC组PPARγ、ACC蛋白表达量显著增加（P<0.05）,AMPK、p-AMPK蛋白表达量及p-AMPK/AMPK显著下降（P<0.05）。【结论】 40 μmol/L葛根素能够显著增加脂肪细胞中甘油三酯含量,显著上调成脂分化基因PPARγ、C/EBPα、ACC的表达量,显著下调AMPK各亚基的表达量,AMPK激活剂AIRCR可显著抑制葛根素的作用,说明葛根素可通过抑制AMPK通路调节松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化。     

鸡脂蛋白酯酶基因启动子的克隆及活性分析

本文旨在研究鸡脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)启动子的结构和启动子活性。采用PCR方法扩增了鸡LPL基因5′侧翼区2kb的DNA片段,对其进行克隆、测序及序列分析后,构建了其全长及系列截断突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞(DF-1),用双荧光素酶报告系统测定了荧光素酶活性。生物信息学分析发现,鸡LPL基因启动子区存在Oct-1、GCbox、CCAAT、GATA、AP1等调控元件,在启动子-575～+137bp区域内存在一个CpG岛。报告基因分析表明,鸡LPL基因的启动子-359～+163bp区域就具有启动子活性,启动子-601～+163bp区域具有最强的启动子活性。结果显示,鸡LPL基因受多种转录因子和上游序列的调控,本研究为深入研究鸡LPL基因的表达调控机制奠定了基础。     

在GW9662作用下共轭亚油酸对断奶仔猪淋巴细胞炎性细胞因子分泌的影响

实验主要探讨了GW9662对过氧化物酶体增殖物激活受体(γPPAR)γ的拮抗作用,以及PPARγ被拮抗后共轭亚油酸(CLA)对淋巴细胞炎性细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响。实验1设置5个处理:淋巴细胞培养体系中GW9662添加量分别为0、5、10、20μmol/L和40μmol/L。实验2设6个处理:空白对照组、20μmol/L的GW9662组、CLA处理组(c9,c11-CLA或t10,c12-CLA各100μmol/L)、CLA(c9,t11-CLA或t10,c12-CLA各100μmol/L)+20μmol/L GW9662处理组。结果表明:淋巴细胞PPARγ活性呈剂量依赖性地被GW9662抑制(P<0.05),而TNF-α和IL-6的分泌则随GW9662添加剂量的增加呈线性或二次曲线变化趋势(P<0.05)。这种变化随着培养体系中CLA的添加而得到缓解,即与20μmol/L GW9662处理组相比,CLA+GW9662处理组TNF-α和IL-6的分泌量显著降低(P<0.05),而与CLA处理组相比,TNF-α和IL-6的分泌量则无显著变化。从本实验可得出,PPARγ活性被GW9662抑制后,添加CLA同样可抑制淋巴细胞炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。     

葛根素对Akt通路调控3T3-L1脂肪细胞分化的影响

为了研究葛根素(puerarin)对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响,探索其在成脂分化过程中的潜在作用机制,试验在脂肪形成过程中将0、10、50μmol/L葛根素加入到诱导分化培养基中诱导分化,分别通过油红O染色法及甘油三酯酶法检测葛根素对3T3-L1脂肪细胞的脂滴积累、甘油三酯的影响;采用实时荧光定量PCR检测脂肪细胞中CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达量,Western blotting检测脂肪形成相关转录因子及Akt信号通路的蛋白水平的表达量。结果表明,10μmol/L葛根素极显著增加了成熟脂肪细胞中脂滴和甘油三酯(TG)的积聚,极显著促进了脂肪形成相关转录因子C/EBPα和PPARγ的mRNA和蛋白水平的表达量(P0.01)。进一步研究发现,与对照组相比,葛根素的刺激可增强Akt信号通路Ser473蛋白的磷酸化表达水平,表明葛根素对成脂分化过程的促进作用很大程度上是通过Akt信号通路的磷酸化来实现的。综上所述,葛根素能够促进3T3-L1前体脂肪细胞的分化,改善胰岛素敏感性,其作用机制与激活Akt信号通路Ser473位点的磷酸化水平有关。本试验结果可为研究胰岛素的效应机制提供新见解,为胰岛素抵抗相关疾病的治疗提供新思路。     

Ghrelin对鸡脂肪间充质干细胞增殖及分化为脂肪细胞的影响

为探讨Ghrelin对鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs)增殖及分化为脂肪细胞的影响。本研究采用CCK-8法检测不同浓度的Ghrelin对AMSCs增殖的影响,再通过实时荧光定量PCR检测Ghrelin对AMSCs中c-myc和胸苷激酶1(TK1)基因mRNA表达水平的影响。然后,采用化学法对AMSCs进行成脂分化诱导,在此过程中添加不同浓度的Ghrelin,观察AMSCs的形态学变化,油红染色测定甘油三酯的累积情况,并通过实时荧光定量PCR检测脂肪细胞分化转录因子过氧化物酶体增殖剂活化受体γ(PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)基因mRNA表达水平的变化。结果显示,10-7~10-11 mol/L浓度的Ghrelin均能显著或极显著促进AMSCs的增殖,其中10-9 mol/L浓度的Ghrelin的促增殖作用最强;Ghrelin也能显著或极显著升高c-myc和TK1基因mRNA的表达量。同时,Ghrelin促进AMSCs分化为脂肪细胞过程中甘油三酯的累积和脂滴的形成,显著或极显著升高PPARγ和C/EBPα基因mRNA的表达水平。结果说明,Ghrelin能够促进AMSCs增殖及分化为脂肪细胞。其分子调节机制可能是,Ghrelin通过增加c-myc的含量,进而引起TK1的活化,从而导致细胞周期的激活,促进AMSCs增殖;Ghrelin可能通过促进PPARγ和C/EBPα的表达,从而促进AMSCs分化为脂肪细胞。     

基于Mx启动子和荧光素酶报告基因定量检测鸡Ⅰ型干扰素生物学活性的研究

为了探索并建立快速、敏感、准确的Ⅰ型干扰素生物学活性定量分析方法,本研究克隆了鸡Mx启动子（Mxp）,并在其下游连接荧光素酶（Luciferase,luc）报告基因,构建鸡Ⅰ型干扰素活性检测质粒pMxp-luc。以pMxp-luc瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,24 h后用鸡IFN-α/β处理细胞,结果荧光素酶基因在Mx启动子的作用下获得转录表达;荧光素酶的表达量与干扰素的抗病毒活性有着良好的线性相关性,并在干扰素处理细胞6 h后就可以检测;对鸡IFN-α和IFN-β检测的敏感性分别约为抗病毒活性定量检测方法的10和100倍。该检测系统与传统抗病毒定量检测方法相比,具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等优势,在禽类乃至哺乳动物干扰素生物学基础和应用研究及产业化过程中具有重要应用价值。     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对李斯特菌感染的影响

为检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响。将不同浓度抑制剂LY294002与细胞共同孵育,MTT法检测不同浓度抑制剂LY294002对细胞活性的影响,然后将L.monocytogenes分别感染细胞,利用菌落计数法计算L.monocytogenes的胞内细菌数量,检测LY294002对L.monocytogenes介导的小鼠生存曲线的影响,利用试剂盒检测抑制剂LY294002对L.monocytogenes介导的LDH和IFN-γ分泌的影响。抑制剂LY294002在5μmol/L、10μmol/L或20μmol/L浓度时不影响细胞活性,LY294002显著抑制了L.monocytogenes的胞内和脏器内细菌数量,提高L.monocytogenes介导的小鼠存活率,分别显著提高和降低L.monocytogenes介导的IFN-γ水平和LDH水平(P0.05)。本研究表明,LY294002可调控细胞内Lm的存活,为L.monocytogenes引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。     

自噬在ZEA对睾丸支持细胞细胞周期影响中的作用

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)雄性生殖毒性的机理,本试验展开了ZEA对睾丸支持细胞细胞周期的影响以及自噬在ZEA对睾丸支持细胞细胞周期影响中的作用研究。试验以原代睾丸支持细胞为材料,分别以浓度为0(对照组),0.1,1,10,20,30μmol/L ZEA进行染毒,24h后利用CCK-8法、流式细胞术、免疫荧光技术和Western blot等进行ZEA对睾丸支持细胞的活率、细胞周期分布、LC3聚点、自噬及细胞周期相关蛋白等影响的检测。流式细胞术检测结果显示:与对照组比较,当ZEA浓度高于10μmol/L时,G0/G1期比例显著下降(P<0.05),G2/M期的比例极显著升高(P<0.01);与20μmol/L ZEA组相比,自噬抑制剂(CQ)+20μmol/L ZEA组细胞周期的G2/M期的比例显著降低(P<0.05),自噬促进剂(RAP)+20μmol/L ZEA组细胞周期的G2/M期的比例显著升高(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,当ZEA浓度高于10μmol/L时,产生LC3荧光信号的细胞数目较对照组呈极显著性升高(P<0.01)。Western blot检测结果显示:与对照组比较,当ZEA浓度高于10μmol/L时,LC3蛋白的表达量呈极显著性升高(P<0.01),CDK4、CyclinD1等细胞周期蛋白的表达显著降低(P<0.05);与20μmol/L ZEA组相比,CQ+20μmol/L ZEA组CyclinD1、CDK4等蛋白的表达量上升(P<0.05),RAP+20μmol/LZEA组CyclinD1、CDK4等的表达量下降(P<0.05)。结果表明:ZEA能诱导睾丸支持细胞发生自噬,并使睾丸支持细胞发生G2/M期阻滞,且存在剂量依赖性;促进自噬可导致细胞周期阻滞在G2/M期,造成M期延长,而自噬的缺陷可以部分逆转ZEA诱导睾丸支持细胞周期G2/M期的阻滞。在一定浓度范围内,ZEA能显著抑制睾丸支持细胞的增殖,细胞自噬在这一过程中起促进作用。