培养组学在动物肠道微生物应用的研究进展

肠道微生物被称为动物的"隐藏免疫器官",不仅能参与宿主代谢还能影响宿主的免疫系统,对维持机体健康至关重要。作者主要介绍了培养组学的发展历程及其对动物肠道微生物研究的重要意义、传统微生物培养方法和分子生物学方法在研究微生物时各自的优、缺点。培养组学是基于传统微生物培养方法同时采用多种培养条件进行微生物培养,再辅以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序技术建立的一种新型微生物分离、鉴定方法,该方法将传统微生物培养技术与分子生物学技术的优点融为一体。该方法在挖掘"新微生物"的研究中,具有发现、找到并获得的优势;在微生物的研究中可定制分离目标菌株进行验证,并能通过丰富注释清楚地了解肠道微生物组。此外,分析了培养组学分别在家禽肠道、猪肠道、反刍动物肠道等动物肠道的研究应用现状,提出了环境条件对肠道微生物的影响,如人类接触对肠道菌群的影响、同物种不同性别肠道菌群的差异,以期为培养组学在动物肠道微生物的研究运用中提供参考。     

反刍动物瘤胃微生物培养组学研究进展

瘤胃微生物被称为反刍动物的“隐藏器官”,与宿主营养物质的获取和生理健康的维持密切相关;目前宏基因组测序发现瘤胃中超过5 800个基因组,然而超过90%的微生物尚未被培养,处于“生物信息黑箱”^[1]中。培养组学是一种采用多种培养条件,结合高通量测序技术鉴定菌种的培养方法。高通量、并行化的培养组学技术在瘤胃微生物中的应用,为在菌株水平上研究重点菌株功能及其与宿主互作关系提供了新的视角。然而,目前培养组学运用于瘤胃微生物的研究仍然较少,尚处于起步阶段。本文从瘤胃微生物特点、培养组学技术及其在瘤胃微生物培养中的应用现状、面临挑战等方面进行综述,为不断优化、规范化培养组学研究方案、拓展瘤胃可培养菌株资源、加快瘤胃生物信息黑箱的破解提供思考。     

应用酵母培养物调控瘤胃微生物区系研究进展

通过调控瘤胃微生物区系来加强反刍动物对粗饲料的利用近年来成为研究的热点。目前存在许多方法用以调控瘤胃微生物区系，如应用离子载体和抗生素。但对于饲料工业中应用抗生素所引起的问题和寻求安全饲料的广泛关注，促使研究者致力于发展一种新型非抗生素或“天然”的饲料添加剂。微生物饲料添加剂，即直接饲喂微生物（DFM），完全满足发展需求，因而被推到了历史前台。DFM包括细菌、酵母（真菌）等，许多研究证明DFM使用效果良好，尤其是酵母培养物（YeastCulture，YC）。YC是经严格控制条件的液体、固体二级发酵或直接在固体培养…     

小麦日粮NSP和木聚糖酶对肉仔鸡肠道微生物区系的影响

肠道微生物菌群是所有动物消化系统的一个组成部分,由于肠道微生物都是活的有机体,也就是说它们的生存需要营养和空间,这就意味着动物的消化系统对营养物质消化和吸收的能力,部分依赖于其中寄居的微生物菌群的分布及其总量。研究表明,不同微生物菌群的分布决定了代谢过程的范围     

基于宏基因测序的微生物饲料添加剂菌群结构及质量分析

随着饲料端全面禁抗，养殖端进入减抗、限抗时代，微生物饲料添加剂行业迎来了新的机遇。然而，如果在生产过程中控制不严，会造成产品的微生物污染，因此，需要对产品中的菌群结构进行分析，以保证产品质量。本文以4年采集的113个市售微生物饲料添加剂产品为研究对象，利用宏基因组测序、物种注释和统计学分析，研究微生物饲料添加剂产品的菌群结构和分布规律。结果表明：64.60%的微生物饲料添加剂样品存在非标识菌污染，主要表现在副地衣芽孢杆菌被误用为地衣芽孢杆菌、含有具有抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌|污染菌中非致病菌主要是贝莱斯芽孢芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌、卷曲乳杆菌|致病菌主要是肺炎克雷伯菌，检出比例为5.98%|其次是蜡样芽孢杆菌，检出比例为12.82%。综上，宏基因测序技术可有效监测微生物饲料添加剂产品的菌群结构，非靶向检测产品中的污染菌。目前，产品存在检测菌种与标识不符、标识菌含量偏低、部分产品存在杂菌甚至致病菌的问题。本研究使用的非靶向研究方法和统计学得到的高频污染菌信息对微生物饲料添加剂产品的质量控制和行业监管具有重要参考意义。 [关键词] 微生物饲料添加剂|禁抗|宏基因组测序|菌群结构     

动物消化道微生物培养组学研究进展

自然环境中绝大部分微生物仍"尚未被培养",这极大限制了人们对微生物功能的研究,以及微生物资源的开发和利用.培养组学基于微生物基因组信息获得目标微生物的最佳生存环境,利用膜扩散型培养技术、微流控型培养技术和细胞分选培养技术等从自然环境中分离、培养"尚未被培养"的微生物,并通过高通量组学技术加以鉴定.已成功应用于小鼠、白蚁...     

核桃青皮水提物对肉鸡肠道微生物菌群结构的影响

试验旨在研究核桃青皮水提物对肉鸡肠道微生物菌群丰度和多样性的影响,初步揭示核桃青皮水提物对肉鸡肠道微生物菌群结构的影响。选取240只1日龄本地土杂鸡,随机分为2组,1个对照组和1个试验组,每个组设4个重复,每个重复30只。试验组于28日龄开始在饮水中添加核桃青皮水提物,6周后,每个重复采集10份肉鸡肛门棉拭子,利用Illumina Miseq测序平台对微生物16S rDNA V3-V4区扩增产物进行双端测序,分析微生物群落结构多样性。高通量测序结果显示,所有样本共含有个17菌门和48个菌属;多样性指数分析结果表明,饲喂核桃青皮水提物的肉鸡肠道菌群丰富度增加。从门水平分析,厚壁菌门（Firmicutes）丰度升高了2.21%（P > 0.05）,变形杆菌门（Proteobacteria）丰度降低了2.22%（P > 0.05）;从属水平上分析,大肠杆菌属（Escherichia）丰度降低了5.35%（P < 0.05）,肠球菌属（Enterococcus）丰度升高了9.63%（P < 0.05）。本研究结果表明,饲喂核桃青皮水提物后肉鸡肠道菌群多样性显著增加（P < 0.05）,据此推测,核桃青皮水提物能有效调节肉鸡肠道菌群并有益于肠道健康。     

口腔灌服丁酸钠对哺乳羔羊瘤胃内容物和瘤胃上皮微生物区系的影响

旨在研究灌服丁酸钠对哺乳羔羊瘤胃内容物和瘤胃上皮微生物菌群区系的影响。试验选取7对体重相近、胎次一致的10日龄湖羊双胎羔羊，随机分为2组，一组为口腔灌服丁酸钠组(试验组，OB,n=7),另一组为灌服生理盐水组(对照组，CON,n=7)。羔羊在49日龄时屠宰采样，采取瘤胃内容物和瘤胃上皮样品，分别用于挥发性脂肪酸(VFA)及16S rRNA高通量测序分析。结果显示，口腔灌服丁酸钠显著影响了瘤胃内丁酸和总VFA的含量(P<0.05),但并未影响乙酸、丙酸的含量以及乙酸丙酸比值(乙丙比)(P>0.05)。冗余分析(RDA)结果表明，对照组和试验组之间瘤胃上皮微生物菌群结构差异较大，而瘤胃内容物微生物区系的差异较小。对瘤胃内容物微生物来说，灌服丁酸钠显著提高了BS11肠道菌族(Unclassified BS11 gut group)的丰度(P<0.05),显著降低了梭菌目(Unclassified Clostridiales)和丹毒丝菌科(Unclassified Erysipelotrichaceae)的丰度(P<0.05);对瘤胃上皮微生物来说，灌服丁酸钠显著了提高...     

小麦日粮非淀粉多糖和木聚糖酶对肉仔鸡肠道微生物区系的影响

采用传统微生物培养和PCR-DGGE 2种方法，针对肠道内几种微生物的数量和优势菌的多样性进行研究。将90只AA肉仔鸡随机分成3组，分别饲喂玉米-豆粕型，小麦-豆粕型和小麦-豆粕型添加木聚糖酶3种日粮。结果表明，小麦非淀粉多糖有增加肠道内几种微生物数量的趋势，其中显著增加了回肠和盲肠厌氧菌总数以及盲肠粪链球菌数量（P＜0．05），而PCR-DGGE结果表明，小麦NSP改变了肠道内微生物的种群结构，降低了种群的数量（P＜0．05）。添加木聚糖酶对回肠和盲肠的微生物数量以及种群数量有影响，但未表现出显著性差异（P＞0．05）。说明小麦非淀粉多糖作为微生物发酵的底物对肠道厌氧微生物产生了增殖效应，但却抑制了其他微生物的生长，导致肠道内微生物结构发生改变。     

基于16S rRNA高通量测序技术分析中国西门塔尔牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究

为系统探讨中国西门塔尔牛瘤胃内的微生物多样性及其功能,本试验利用16S rRNA基因高通量测序技术检测分析西门塔尔牛(20月龄,平均体重约为550 kg)瘤胃液样本菌群结构并进行PICRUSt功能预测。结果显示,两组样本通过Illumina Miseq测序平台共获得66 712条优质序列,聚类分析得到1 797个操作分类单元(OTU),经分类学鉴定分属13个门20个纲22个目33个科及59个属;厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群,所占比例分别为62.46%和22.45%;基于属的组成,依次为粪杆菌真核菌群([Eubacterium]_coprostanoligenes_group,9.16%)、瘤胃球菌属_2 (Ruminococcus_2,7.90%)、未知属f型拟杆菌目RF16菌群(norank_f__Bacteroidales_RF16_group,6.23%)、未知属f型瘤胃菌科(norank_f__Ruminococcaceae,4.79%)、理研菌科_RC9菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group,4.72%)、未知属f型拟杆菌目BS11菌群(norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group,4.49%)、瘤胃球菌属_1(Ruminococcus_1,4.43%)等;16S rRNA基因组的PICRUSt功能预测发现,瘤胃菌群功能主要集中在碳水化合物转运及代谢上,可能含有大量的纤维素和木质素降解酶基因。综上,基于16S rRNA基因的高通量测序技术全面揭示了西门塔尔牛瘤胃菌群的多样性,并预测其含有丰富的蛋白质分解、木质纤维素降解酶系,为探索西门塔尔牛瘤胃微生物奠定基础,也为进一步挖掘与某些重要营养生理功能密切相关的瘤胃微生物功能基因提供参考。     

The Application of Microbiome Culturomics in Veterinary Medicine

Under laboratory conditions, the number of cultured microorganisms accounts for about 1% of the total number of microorganisms in nature, which limits people's understanding and utilization of 99% of the unknown microorganisms. However, relevant researches show that those "uncultured microorganisms" can be developed and utilized, and the uncultured microorganisms are the main body of the unknown microorganisms. The microbial culturomics explored the application of multiple culture conditions and long-term culture, it was combined with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) and 16S ribosomal RNA (rRNA) sequencing to identify all kinds of microorganisms on a large scale. At the same time, whole-genome sequencing (WGS) and Metagenomics sequencing technology were used to analyze unknown microorganisms in depth. In this paper, the latest progress of culturomics in the ruminant gastrointestinal tract, poultry cecum, and livestock nasal microflora in recent years was reviewed, and the feasibility of applying the method of microflora culturomics in animal disease prevention and control was discussed. As a new research idea, culturomics has some immature aspects, but its development prospect is very broad. The complementary of microflora culturomics and other research methods have gradually become a breakthrough in the development of veterinary microbiology.     

猪肠道细菌培养组学研究进展

猪肠道菌群是由所有定殖在猪肠道里的大量细菌、病毒、真菌和古菌等构成的集合。已有研究表明,很多疾病以及猪重要经济性状都与肠道菌群有关。目前,肠道菌群研究使用较多的技术是16S rRNA基因测序和宏基因组测序,但这些技术并不能了解具体菌株的实际功能和生理特性。肠道细菌的分离培养具有特殊重要的意义。近几年来,肠道细菌的培养取得了重要进展,基于培养条件的多样性分离培养出了更多的肠道细菌类别,这对促进肠道菌群在菌株水平的研究以及推广应用有重要意义。本文主要从猪肠道菌群组成结构、培养组学发展、猪肠道细菌培养组学的研究现状等方面进行论述和展望,为后续猪肠道菌群菌株的功能和影响表型的机制研究提供参考借鉴。     

哺乳仔猪断奶前后肠道微生物培养组学研究

近年来国内外研究人员通过下一代测序和分离培养技术,结合宏基因组学相关的生物信息学手段证实了猪肠道微生物的组成及其代谢物活性对宿主的健康具有重要作用。受限于传统培养方法,猪肠道中大多数细菌仍无法培养,因此,为了突破研究人员研究宿主-菌株相互关系及益生菌株开发应用的限制,本研究对仔猪断奶前后回肠和结肠内容物微生物进行高通量培养组学研究。结合需氧和厌氧条件、不同培养时间以及25种不同培养基,共筛选获得1385株厌氧、好氧和兼性厌氧菌株,并全部进行了16S rRNA全长测序鉴定和菌株保存,共计获得5个门、29个属和86个种菌,其中包含梭杆菌、拟杆菌等在以前的研究中较难分离获得的菌株,以及一些如乳酸菌等具有潜在应用价值的益生菌,更为重要的是其中包含116株疑似新菌种。本研究获得的菌株信息可以进一步完善猪肠道微生物物种数据库,为后续宿主-菌株相互关系研究垫定了基础,对猪饲用益生菌相关产品开发研究具有重要意义。     

益生菌剂对仔猪肠道菌群的影响

为研究益生菌剂对仔猪肠道菌群的影响,选择60头7.5 kg左右的"杜洛克猪×长白猪×大白猪"原种猪,随机分成2组,每组3个重复,每个重复10头。将仔猪分为试验组和对照组,对照组饲喂基础日粮,试验组饲喂基础日粮+0.1%益生菌剂,检测各组仔猪生产性能及肠道菌群等。试验结果表明,益生菌制剂能显著降低仔猪腹泻率(P<0.05),促进仔猪的生长;大肠杆菌和肠球菌是仔猪肠道非常住菌群(过路菌),乳酸杆菌、双歧杆菌、产气荚膜梭菌为常住菌群;益生菌剂能极显著减少仔猪肠道的好氧菌(P<0.01),极显著增加仔猪肠道的厌氧菌、双歧杆菌和乳酸杆菌(P<0.01),显著降低仔猪肠道的产气荚膜梭菌(P<0.05)。因此,饲料中添加益生菌剂能有效改善仔猪肠道菌群。     

T-RFLP分析技术在肉鸡肠道微生物研究中的应用

本文阐述了末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析技术的基本原理和技术路线,讨论了应用T-RFLP分析技术相对于应用传统方法研究肉鸡肠道微生物的优势,总结了应用T-RFLP分析技术研究肉鸡肠道微生物的发展历程,分析了应用T-RFLP分析技术研究肉鸡肠道微生物存在的问题及解决方法,并对其应用前景进行了展望.     

应用高通量测序技术分析青海牦牛引进山东后瘤胃菌群的变化

试验旨在探讨不同的饲养环境及日粮结构对牦牛瘤胃菌群结构的影响，应用高通量测序技术分析了青海牦牛引进山东后的瘤胃菌群变化情况。结果表明，青海牦牛瘤胃液可见物种（Observed species）及Chao1指数（Chao1 index）与引进牦牛瘤胃液相比差异极显著（P<0.01），ACE指数差异显著（P<0.05）；青海牦牛菌群丰度显著高于引进牦牛，说明青海牦牛引进山东后瘤胃菌群丰度发生了显著变化，而引进前后牦牛瘤胃液香浓指数（Shannon index）以及辛普森指数（Simpson index）差异不显著（P>0.05），说明青海牦牛引进山东后瘤胃菌群多样性未显著改变。测序数据表明，牦牛瘤胃液中丰度较高的菌群依次是拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门、互养菌门、软壁菌门、纤维杆菌门；青海牦牛引进山东后菌群结构比例变化显著的门是浮霉菌门和装甲菌门（P<0.05），变化显著的属是颤杆菌克属和帕匹杆菌属（P<0.05）。数据分析得出，拟杆菌和理研菌科在青海牦牛瘤胃液中起重要作用，而普雷沃氏菌科、琥珀酸弧菌科和产气单胞菌在引进山东牦牛瘤胃液中起主要的作用，推测饲养环境及日粮结构的改变导致了瘤胃菌群及其相关功能的改变。本研究为地域和日粮结构的变化对牦牛瘤胃菌群结构的影响提供了理论依据。     

单胃动物肠道菌群与宿主肠道免疫系统的互作关系及可能机制

单胃动物的肠道中存在着庞大而复杂的菌群,它们与宿主肠道免疫系统协同进化。肠道细菌及其代谢产物在维持肠道稳态方面发挥着重要的作用。正常的肠道菌群能促进免疫系统发育,参与维持宿主免疫功能,协同拮抗病原菌的增殖和入侵。反过来,宿主肠道免疫系统对肠道菌群又有制约和调控作用,如对正常共生菌表现为免疫耐受,对病原菌表现为免疫排斥。一旦这种动态平衡被破坏,就会导致疾病的发生。本文综述了单胃动物肠道菌群与宿主肠道免疫系统的相互关系,并基于现有的研究结果,对其可能的互作机制做了较为系统的总结。     

鸭疫里默氏菌感染对鸭肠道菌群结构的影响

试验旨在分析鸭疫里默氏菌（RA）感染不同时期鸭肠道菌群结构变化规律，探讨鸭疫里默氏菌对鸭肠道微生物的影响及引起鸭致病的可能机制。采用细菌16S V4-V5区扩增通用引物，扩增鸭疫里默氏菌未感染组（鸭疫里默氏菌感染0 d组），鸭疫里默氏菌感染后1、2、3、5、9和14 d的鸭直肠内容物样本DNA，将扩增得到的产物进行DNA建库后基于Ion S5^TMXL测序平台测序。测序得到的Raw Reads数据总量为4 710 688条序列，平均每个样本84 119条序列。共注释到数据库的操作分类单元（OTUs）数目为4 528。Alpha多样性分析结果表明，菌群多样性指数Shannon和Simpson在鸭疫里默氏菌感染组和未感染组间差异不显著（P>0.05），菌群丰富度指数Chao1、Ace、Observed-species和PD-whole-tree在鸭疫里默氏菌感染后0~5 d逐渐降低，从5~14 d又逐渐增加，尤其在鸭疫里默氏菌感染后3和5 d均显著低于未感染组（P<0.05）。Beta多样性分析表明，未感染组与6个时间点的感染组间菌群差异均显著（P<0.05），其中，未感染组与感染后3 d的物种差异最大，之后依次为感染后2、5、9、1和14 d。物种丰度聚类热图显示，在未感染组和不同时间感染组，物种丰度相对较高的微生物菌属均不同。在门水平，鸭疫里默氏菌感染组主要以厚壁菌门（Firmicutes）、unidentified-Bacteria、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）及变形菌门（Proteobacteria）为主；在属水平，Bacteroides在感染组和未感染组均为优势菌属，感染组中弯曲杆菌属（Campylobacter）和梭杆菌属（Fusobacterium）明显增加。本试验分析了鸭疫里默氏菌未感染组和感染不同时间组肠道菌群的差异，寻找到一些特征菌属，可为鸭疫里默氏菌的致病性研究提供理论依据。     

家畜消化道菌群的分子生物学研究方法

消化道菌群多样性对于维持家畜机体健康起着至关重要的作用,因此,对家畜消化道中定植菌群的种类和功能进行分析就显得尤为关键。由于所有动物的消化道是厌氧环境,所以在体外的好氧环境中,有些菌种不易培养,而这些菌种信息的缺失,会导致消化道优势菌群的分析结果出现偏差。借助一些广泛应用的分子生物学研究方法,可以避免这种情况的发生。这些方法主要是测序法和定性定量分析法。测序法包括指纹图谱法和高通量测序法,定性定量分析法包括荧光原位杂交法和实时荧光定量PCR法。这些方法均基于分子生物学水平,可避免菌体培养步骤,直接分析消化道菌群的组成和功能。综述了上述方法的原理以及各自的优点和缺点,并对它们在动物消化道菌群多样性分析中的应用进行了讨论,以期为研究动物消化道微生物时不同分子生物学方法的选择和联合使用提供参考。