培养组学在动物肠道微生物应用的研究进展

肠道微生物被称为动物的"隐藏免疫器官",不仅能参与宿主代谢还能影响宿主的免疫系统,对维持机体健康至关重要。作者主要介绍了培养组学的发展历程及其对动物肠道微生物研究的重要意义、传统微生物培养方法和分子生物学方法在研究微生物时各自的优、缺点。培养组学是基于传统微生物培养方法同时采用多种培养条件进行微生物培养,再辅以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序技术建立的一种新型微生物分离、鉴定方法,该方法将传统微生物培养技术与分子生物学技术的优点融为一体。该方法在挖掘"新微生物"的研究中,具有发现、找到并获得的优势;在微生物的研究中可定制分离目标菌株进行验证,并能通过丰富注释清楚地了解肠道微生物组。此外,分析了培养组学分别在家禽肠道、猪肠道、反刍动物肠道等动物肠道的研究应用现状,提出了环境条件对肠道微生物的影响,如人类接触对肠道菌群的影响、同物种不同性别肠道菌群的差异,以期为培养组学在动物肠道微生物的研究运用中提供参考。     

长双歧杆菌BBMN68菌株的耐氧驯化研究

双歧杆菌是一种经典的益生菌,其对人体健康的促进作用已得到了广泛的研究证明,在功能食品及药品中具有巨大的应用价值。目前成功应用的双歧杆菌多局限于耐氧能力较强的动物双歧杆菌。由于双歧杆菌对氧敏感的特点,大量性能优良菌株的应用受到了限制,而耐氧驯化是解决这一问题的有效手段。通过逐步提高氧分压的方式对一株来自长寿老人肠道的双歧杆菌BBMN68进行耐氧驯化,成功分离到1株耐氧能力提高的菌株;通过16S r DNA测序确定驯化菌株具有稳定的遗传性;通过原始菌株及驯化菌株对酸及胆盐的耐受能力测定,确定驯化菌株具有稳定的耐受性能。     

选择性培养基结合特异引物法分离鉴定家兔肠道脆弱拟杆菌

脆弱拟杆菌作为严格厌氧菌,对培养环境要求苛刻,分离培养有较大难度。试验通过改进的选择性培养结合特异引物方法分离兔源脆弱拟杆菌,并利用16srDNA测序对其进行鉴定,为后续研究其与宿主关系奠定基础。试验从健康青年家兔肠道中采集内容物,先接种于含液态选择性培养基的厌氧管中,进行富集培养1~2d,然后将培养的菌液稀释后接种到选择性培养基平板上,于厌氧罐中培养1~3d,待长出菌落后,观察菌落形态,挑选符合脆弱拟杆菌菌落特点的单一菌落,培养后提取DNA,以脆弱拟杆菌特异引物进行PCR检测。对扩增出特异条带的菌株,扩增其16srDNA序列,并进行测序,测序结果与GenBank中脆弱拟杆菌序列进行比对,以鉴定分离的菌株。结果表明,细菌为大小不一的杆菌,革兰氏染色呈阴性。特异引物PCR产物电泳检测显示,挑取的27株单一菌落中,有7株可以扩增出符合目的片段大小的产物。随机选取两株进行16srDNA测序,其序列与GenBank中的递交的脆弱拟杆菌序列相似度大于99%,与其他细菌相似度均小于93.43%,可确定分离到的菌株为脆弱拟杆菌。     

猪肠道细菌培养组学研究进展

猪肠道菌群是由所有定殖在猪肠道里的大量细菌、病毒、真菌和古菌等构成的集合。已有研究表明,很多疾病以及猪重要经济性状都与肠道菌群有关。目前,肠道菌群研究使用较多的技术是16S rRNA基因测序和宏基因组测序,但这些技术并不能了解具体菌株的实际功能和生理特性。肠道细菌的分离培养具有特殊重要的意义。近几年来,肠道细菌的培养取得了重要进展,基于培养条件的多样性分离培养出了更多的肠道细菌类别,这对促进肠道菌群在菌株水平的研究以及推广应用有重要意义。本文主要从猪肠道菌群组成结构、培养组学发展、猪肠道细菌培养组学的研究现状等方面进行论述和展望,为后续猪肠道菌群菌株的功能和影响表型的机制研究提供参考借鉴。     

猪源乳酸杆菌齐市地方株的分离与种属分析

为了分离出可用于研制猪用微生态制剂的乳酸杆菌菌株。选择齐齐哈尔市龙江县,甘南县,富裕县及泰来县等地区相关猪场,采集21～35日龄健康仔猪肠道粪样15份。选用MRS琼脂培养基分离培养乳酸杆菌,通过分离菌株的形态特征和培养特性筛选出革兰氏阳性,厌氧,无芽孢杆菌16株。再通过生理生化鉴定法,确定5株为乳酸杆菌。其中,嗜酸乳杆菌2株,植物乳杆菌2株,干酪乳杆菌1株。     

嗜热双歧杆菌RBL67与低聚果糖对哥廷根小型猪肠道菌群的影响

通过饮食干预调节肠道菌群是提高宿主防御机制的常用措施。多项体外研究表明嗜热双歧杆菌RBL67具有抗沙门氏菌的作用,从而被用作益生菌。本研究旨在阐明RBL67或RBL67与低聚果糖(FOS)联合应用对哥廷根小型猪肠道菌群的影响。试验采用横断面研究设计,分组如下:对照组(control),基础日粮添加8克/天的脱脂奶粉;益生菌日粮组(PRO),基础日粮基础添加8克/天益生菌菌粉(1×109CFU/克脱脂奶粉);合生素组(SYN),基础日粮添加8克/天益生菌菌粉和8克/天FOS。运用焦磷酸16S r RNA测序和定量PCR方法分析粪便和盲肠内容物微生物的组成。采用高效液相色谱法(HPLC)测定结肠和盲肠的代谢活性。16S r RNA基因扩增子测序表明小型猪的粪便菌群与猪的微生物菌群相似。试验期间到试验结束,PRO和SYN组的粪便、盲肠和结肠内容物均能持续检出RBL67,检出量达105~10616S r RNA拷贝/克。试验结束时,SYN组小型猪的盲肠和结肠中双歧杆菌的数量显著高于PRO组。结果表明哥廷根小型猪适合作为研究猪肠道菌群的动物模型。同时,本研究首次在体内研究证实与FOS联合使用可以提高益生菌在消化道内的数量及存活率,为益生菌在饲料和食品中的应用提供了理论基础。     

猪源唾液乳杆菌株SIL1的特性及应用

为了获得优良的猪用益生菌株,从断奶仔猪消化道分离一株乳酸菌SIL1,利用16S rRNA技术进行鉴定,研究了茵株的抗逆性,并采用PCR-DGGE及16S rRNA技术分析其对肠道茵群失调小鼠粪便茵群的影响.结果表明,从断奶仔猪回肠内容物分离的菌株SIL1为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius),...     

两株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

从疑似副猪嗜血杆菌病发病猪场采集58份病料,分离到2株革兰氏阴性短小杆菌.对分离菌株进行培养特性、生化特性、血清型分型研究以及PCR检测和测序分析,结果表明,分离的两株细菌均为血清4型副猪嗜血杆菌.对分离菌株进行药敏试验分析,结果显示分离株对头孢噻肟、头孢噻吩、替米考星高度敏感,对四环素、丁胺卡那、恩诺沙星、环丙沙星中度敏感,对甲氧苄氨嘧啶、复方新诺明、链霉素、阿莫西林、新霉素均耐药.     

复合乳杆菌制剂对仔猪生产性能和免疫功能的影响

乳酸杆菌是猪肠道菌群的重要成员,在促进猪健康方面发挥重要作用。断奶期仔猪肠道乳酸杆菌数量会减少,这已被认为是导致仔猪肠道菌群紊乱综合征(如腹泻)的原因。因此,在断奶期日粮中添加乳酸菌可能有助于仔猪保持更好的健康水平。本研究中,我们评估了一种包含6种乳杆菌(L.amylovorus,L.mucosae,L.salivarius,L.johnsonii和2株L.reuteri)的复合益生菌制剂在断奶仔猪上应用效果。从5窝仔猪中挑选20头相同性别和相似体重仔猪,平均分成2组(n=10)。益生菌组仔猪每日饲喂乳酸杆菌的混合物(总细胞数1×1010),试验持续3周,对照组则饲喂无益生菌的安慰剂。本研究旨在评估所饲喂复合益生菌制剂在肠道的存活能力以及对仔猪生产性能的影响;此外,也分析了肠黏膜部分细胞因子的基因表达。实验结果表明:复合益生菌主要作用在于调节仔猪肠道免疫功能,尤其是大肠。添加复合益生菌组仔猪盲肠的IL-4和IFN-γ的表达上调而结肠IL-8和TNF表达下调。此外,复合益生菌制剂也明显下调了仔猪空肠、回肠和结肠的TGF-β1基因表达。复合益生菌增加了仔猪空肠中的总菌数,但对肠食糜的p H值或肠道中乳杆菌的数量没有明显影响。此外,从粪便中不能分离到所饲喂的益生菌株,表明它们不能在肠道中定植并增殖。复合益生菌制剂对仔猪日增重或肠黏膜形态没有明显影响。虽然在本研究中饲喂益生菌制剂未能实现促生长效果,并且饲喂菌株在与肠道内源微生物竞争中不具有优势,但复合益生菌制剂促进了仔猪肠道免疫调节功能。     

一株猪源屎肠球菌的分离及其种属鉴定

为分离出可用作猪用微生态制剂的肠道益生菌株,本研究选择锦州市凌海大业乡生态猪场为试验采样点,采集10日龄左右健康仔猪肠道粪样12份。利用MRS琼脂培养基分离培养初筛目标分离菌株的形态特征和培养特性,再通过生理生化鉴定法和16SrRNA基因分子鉴定法,最终确定1株分离菌为屎肠球菌,并命名为LN/EF1312株,为后续肠道益生球菌的益生功能研究奠定了物质基础。     

巴拉圭地区传统发酵乳制品中乳酸菌的分离鉴定

为获得更加丰富的乳酸菌资源，系统研究巴拉圭地区传统乳制品中乳酸菌的生物多样性，采用传统纯培养方法结合16S rRNA基因序列分析技术和系统发育进化关系分析技术对巴拉圭地区传统乳制品中乳酸菌进行分离纯化和种属鉴定。结果表明，来自巴拉圭地区的8 份传统乳制品中共分离得到79 株乳酸菌，分属于4 个属、7 个种，其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）为巴拉圭地区传统发酵乳中的优势菌种，占总分离菌株的68.35%。     

复合益生菌对生猪健康状况影响的研究进展

益生菌作为一种新型抗生素替代品被广泛应用于畜牧业中。文章从乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌复合益生菌能够促进生猪对营养物质的消化吸收和肠道发育,维持肠道菌群平衡,进而改善生猪肠道健康等方面进行阐述,为其在生猪上的应用提供参考。     

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道菌群结构及优势菌群,获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛成虫肠道中提取细菌基因组DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物27F/1495R和27F/519r+GC进行V3可变区PCR扩增,将长约500 bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后,进行优势条带分析、DNA回收、克隆、测序等,初步得到分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的8个细菌菌株,其中优势细菌为克雷伯氏菌属的细菌菌株,其次是沙雷氏菌属的细菌菌株。将获取的细菌16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析,相似度在97%以上的有6个菌株,其中有5个菌株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致,表明基于16S rDNA的PCR-DGGE技术可用于桑天牛肠道菌群多样性研究。     

酸奶发酵剂复壮方法研究

为了更加有效地对衰退的发酵剂菌株进行复壮，本研究评价了一种结合连续传代、好氧与厌氧交替培养及分离纯化相结合的方法。用此方法对性能衰退的保加利亚乳杆菌（乳1#杆）及嗜热链球菌（乳1#球）进行复壮，得到了良好的效果。与原始菌株相比，复壮菌株的生长性能、产酸性能及产香能力都有了显著的提高。与传统复壮方法相比，此种方法工作量小、复壮效果好，适合用于现代乳品工业中发酵剂性能的保持。     

1株鲤鱼源植物乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

【目的】筛选具有优良益生特性的鲤源乳酸菌作为水产养殖用微生态制剂候选菌株。【方法】以鲤鱼肠道内容物及黏膜为菌株的分离来源，采用MRS培养基进行菌株分离纯化，经16S rRNA测序鉴定后，对分离菌株生长特性、产酸能力、耐酸、耐胆盐、抑菌特性、药物敏感性及安全性等生物学特性进行分析。【结果】试验成功分离到1株植物乳杆菌，将其命名为YY001，该分离株在MRS培养基上菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色，革兰氏染色为阳性、无芽孢、两端钝圆的短小杆菌；4 h后进入对数期生长，12 h后生长达到稳定期；具有较强的产酸能力，产酸曲线显示，0~12 h pH迅速下降，培养16 h的菌液pH达3.8；在pH 3.0和0.3%胆盐的条件下具有一定耐受性；该分离株对水产常见致病菌柱状黄杆菌、维气氏单胞菌和嗜水气单胞菌均具抑菌效果，且对柱状黄杆菌的抑菌效果最显著，抑菌圈直径达34.19 mm；药物敏感性试验结果显示，分离株对卡那霉素、链霉素和万古霉素耐药；每天一次连续1周灌胃10⁸CFU分离菌株对小鼠无毒害作用。【结论】本研究分离到的菌株YY001具有优良的生物学特性，可作为水产养殖用微生态制剂候选菌株，为后续制备鲤鱼用微生态制剂奠定基础。     

益生菌维护肠道健康及抗病毒作用研究进展

动物肠道存在复杂的微生物群落,适宜的微环境有利于多种肠道微生物的定植生长。肠道健康是保证动物机体健康的基础,也是当前国内外学者所关注的热点问题。益生菌是对肠道健康有益的微生物,在改善动物肠道健康领域具有极大的潜力。益生菌对病原微生物侵袭有一定的抑制作用,对部分病毒也具有一定的预防及清除作用,但不同菌株作用效果存在较大差异。作者首先将益生菌对肠道健康的保护概括为益生菌抑制病原菌入侵和定植、改善肠道屏障功能、维持肠道健康菌群、提高机体免疫力4种方式,并探讨了不同菌株的作用方式;其次简述了益生菌抗肠道病毒的作用机制,其中,益生菌通过间接方式调节机体免疫是其抗病毒的主要方式;最后讨论了近年来益生菌在轮状病毒、流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒中应用的研究进展,并对益生菌的发展前景进行了展望,以期为益生菌在改善动物肠道健康的研究及产品的开发方面提供一定的参考依据。     

Intestinal microflora: elimination of germfree characteristics by components of the normal microbial flora.

Strict anaerobic bacteria are the predominant constituents of the intestinal flora of animals and man, the commonly studied aerobic bacteria comprise only a small percentage of the total intestinal flora. Dominating anaerobes include eubacteria, Bacteroides, fusiformis, peptostreptococci, propionibacteria. The intestinal mucosal epithelia is covered with a mucous layer which is extremely rich in anaerobes. Various germfree anomalies may be selectively redressed by various species of the intestinal flora. Obligate and moderate anaerobes are the active strains in elimination of germfree characteristics, in reduction of enlarged cecum in germfree rodents. The metabolic activity of the intestinal bacteria has been discussed.     

Health-beneficial effects of probiotics: Its mode of action

It is now widely recognized that probiotics have health-beneficial effects on humans and animals. Probiotics should survive in the intestinal tract to exert beneficial effects on the host's health. To keep a sufficient level of probiotic bacteria in the gastrointestinal tract, a shorter interval between doses may be required. Although adherence to the intestinal epithelial cell and mucus is not a universal property of probiotics, high ability to adhere to the intestinal surface might strongly interfere with infection of pathogenic bacteria and regulate the immune system. The administration of probiotic Lactobacillus stimulated indigenous Lactobacilli and the production of short-chain fatty acids. This alteration of the intestinal environment should contribute to maintain the host's health. The immunomodulatory effects of probiotics are related to important parts of their beneficial effects. Probiotics may modulate the intestinal immune response through the stimulation of certain cytokine and IgA secretion in intestinal mucosa. The health-beneficial effects, in particular the immunomodulation effect, of probiotics depend on the strain used. Differences in indigenous intestinal microflora significantly alter the magnitude of the effects of a probiotic. Specific probiotic strains suitable for each animal species and their life stage as well as each individual should be found.     

Colonization of the small intestine of weaned pigs by enterotoxigenic Escherichia coli that lack known colonization factors.

Intestinal colonization of 3-week-old weaned pigs by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains that were originally isolated from weaned pigs with fatal diarrhea and that lacked K88, K99, F41, and 987P adhesins (4P- ETEC) was studied by histologic, immunofluorescent, and electron microscopic techniques. In the first experiment, 16 principal pigs were inoculated orogastrically with ETEC strain 2134 (serogroup O157: H19) or 2171 (serogroup 0141:H4), and eight control pigs were not inoculated. In the second experiment, 24 principals were inoculated with ETEC strain 2134, and 12 controls were inoculated with a nonenterotoxigenic strain of E. coli. Principal and control pigs were necropsied at intervals from 24 to 72 hours after inoculation of principals to provide the tissues used for this report. Results from the two experiments and with both ETEC strains were similar and therefore were combined. Adhesion by 4P- ETEC was demonstrated in ileum but not in cecum or colon in 22/40 principal pigs sampled at 24 to 72 hours after orogastric inoculation. Adherent bacteria were most apparent on the intestinal villi covering Peyer's patches. Only occasional adherent bacteria were detected in ileal sections from a few (4/20) of the control pigs. Adherence by 4P- ETEC was characterized by "patches" of bacteria closely associated with the lateral surfaces and less frequently with the tips and the bases of intact villi. In most cases, the adherent bacteria were separated from epithelial cell microvilli and other bacterial cells by a 50-400-nm space. Filamentous bacterial appendages bridged this space and formed a network among adjacent bacteria.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)