表达木质素降解酶的基因工程产朊假丝酵母菌部分生物学特性研究

木质素是农作物秸秆饲用化利用的主要限制因素,现仅有少数微生物产生木质素降解酶,且产量少、酶活低,不适合工业化生产,酶蛋白的高效异源表达是提高木质素降解酶产量的有效途径。工程菌ZHMX4和ZHQX1是分别从黄孢原毛平革菌和云芝栓孔菌中扩增出木质素过氧化物酶基因（lip）和漆酶基因（lac）,利用同源整合重组技术构建所得的工程菌。对前期构建的表达木质素降解酶工程菌ZHMX4和ZHQX1进行了部分生物学特性研究,包括木质素降解酶适宜反应条件、木质素降解酶基因拷贝数和工程菌降解天然木质素能力的测定及工程菌营养需要分析,了解2株工程菌特性的同时为后续研究工作奠定基础。结果显示：工程菌ZHMX4和ZHQX1产木质素降解酶最适反应温度和pH分别为30℃、3.0和30℃、4.5;2株工程菌各2 m L（添加量为109cfu/g）混合对100 g玉米秸秆进行发酵时,木质素的降解率达到50.12%;根据Biolog YT微孔板试验结果,可优化2株工程菌的培养基,在培养基中添加一些营养物质,可促进工程菌的生长。     

马早期流产相关功能基因挖掘的研究

旨在探究与马早期流产相关的功能基因。在同一舍饲马群体中筛选配种后45 d能够检查到胚胎,但2~4个月后发生流产的母马10匹（流产组）,以及能正常分娩的母马10匹（分娩组）。采集马匹血液样本,提取基因组DNA。全基因组平均测序深度为10×,基因组覆盖度97%以上,每个样本大约测得4×10⁶个SNP。对流产组和分娩组的全基因组重测序数据进行比较。结果表明：通过Fst分析获得1 381个SNP位点,π分析获得1 614个SNP位点,联合分析得到203个SNP位点;过滤掉突变基因间区域、非编码区域、内含子和同义SNV后得到82个SNP位点,定位于69个基因上;通过GO term、信号通路富集分析以及文献查阅,筛选出其中的12个基因为马早期流产和胚胎着床的重要候选基因,这些候选基因通过参与激素调节、胚胎侵入、维生素合成代谢等影响胚胎着床。研究结果为揭示引起马匹早期流产的原因提供了生物信息学方面的参考。     

饲喂方式对德州驴生长性能、营养物质消化率和盲肠微生物多样性的影响

本试验旨在研究饲喂方式对德州驴生长性能、营养物质消化率和盲肠微生物多样性的影响。选择体重[(215±10)kg]相近、2周岁左右的健康德州公驴15头,随机分为C1组(饲喂方式为先粗后精)、C2组(饲喂方式为先精后粗)、C3组[饲喂方式为全混合日粮(TMR)],每组5头,预试期7 d,正试期75 d。结果显示:1)C2组平均日增重极显著高于C1和C3组(P≤0.01),C1组干物质和酸性洗涤纤维消化率以C1组最高,C3组次之,C2组最低,C1组与C2组间存在显著差异(P≤0.05)。2)饲喂方式对德州驴盲肠微生物组成有一定影响。在门水平上,各组盲肠微生物均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主(二者占比>75%),其次为螺旋体菌门(Spirochaetes)、变形菌门(Proteobacteria)和纤维杆菌门(Fibrobacteres),且C2组厚壁菌门相对丰度高于C1组和C3组;在属水平上,将401个属中相对丰度低于1%的属聚为其他(占比>75%)后,各组均以其他为优势菌属;随后,C1组以螺旋体科未定义属(unidenti⁃fied⁃Spirochaetaceae)和厌氧孤菌属(Anaerovirbrio)为主,C2组以厌氧孤菌属、链球菌属(Strepto⁃coccus)和螺旋体科未定义属为主,C3组则以乳酸杆菌属(Lactobacillus)和螺旋体科未定义属为主。3)通过UPGMAA聚类树、主成分分析和物种差异性分析发现,3组德州驴盲肠微生物组成不同,且C2组与其他2组差别较大,C1组和C3组可聚为一类。综上可知,饲喂方式可极显著影响德州驴的平均日增重,显著影响干物质和酸性洗涤纤维消化率,并可改变盲肠微生物组成。     

蒙古马和纯血马免疫相关基因差异表达分析

为了评价蒙古马(Equus mongolian horse)和纯血马(E.thoroughbred)免疫生理机能在适应特殊生存环境和人工选择压力过程中相关基因的表达多样性。本研究对健康成年蒙古马(n=3)和纯血马(n=3)的颈静脉血液进行RNA-Seq和品种间表达谱比较分析。对2岁左右健康蒙古马(n=3)和纯血马(n=3)采集肝脏、脾脏、肺脏和血液样品，利用qRT-PCR方法，分析NF-κB信号通路7个基因在两个品种中的表达情况。利用Western blot方法，分析蒙古马和纯血马肺脏中核因子κB亚基p65 (RELA proto-oncogene NF-kB subunit, NF-κB p65)蛋白和白细胞介素1β (interleukin 1 beta, IL-1β)蛋白的表达情况。结果表明，RNA-Seq共获得19.69～23.95 Gb的高质量数据和1 199个差异表达基因，许多差异表达基因直接参与机体的免疫过程。NF-κB信号通路7个基因在蒙古马和纯血马4个免疫组织中均表达，基因表达的品种间差异存在组织多样性；7个基因在蒙古马肺脏的表达量均高于纯血马，除肿瘤坏死因子(tum...     

瘤胃枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其木聚糖酶基因的克隆和在乳酸球菌中表达的研究

通过形态学和16S rDNA序列分析方法,从绵羊瘤胃内容物中分离得到的细菌中鉴定出枯草芽胞杆菌。根据GenBank中已知Bacillus subtilis木聚糖酶基因序列设计带有酶切位点的引物,克隆到2条不同的木聚糖基因序列。通过酶切和连接等相关分子方法成功构建出以pMG36e为载体的表达木聚糖酶的重组质粒,转化到乳酸球菌粒MG1363后,均能高效表达,酶活性分别为28.29 U/mL和7.11 U/mL,比原枯草芽胞杆菌酶活2.17 U/mL高出13.04倍和3.28倍。     

家畜消化道菌群的分子生物学研究方法

消化道菌群多样性对于维持家畜机体健康起着至关重要的作用,因此,对家畜消化道中定植菌群的种类和功能进行分析就显得尤为关键。由于所有动物的消化道是厌氧环境,所以在体外的好氧环境中,有些菌种不易培养,而这些菌种信息的缺失,会导致消化道优势菌群的分析结果出现偏差。借助一些广泛应用的分子生物学研究方法,可以避免这种情况的发生。这些方法主要是测序法和定性定量分析法。测序法包括指纹图谱法和高通量测序法,定性定量分析法包括荧光原位杂交法和实时荧光定量PCR法。这些方法均基于分子生物学水平,可避免菌体培养步骤,直接分析消化道菌群的组成和功能。综述了上述方法的原理以及各自的优点和缺点,并对它们在动物消化道菌群多样性分析中的应用进行了讨论,以期为研究动物消化道微生物时不同分子生物学方法的选择和联合使用提供参考。     

乳酸乳球菌食品级双筛选标记的分泌型表达载体的构建

纤维素酶在畜牧业、饲料工业、生物技术和生物能源利用方面均有广泛应用。纤维素酶基因工程作为研究的重点,可以提高酶产量和稳定性,具有广阔的应用前景。通过利用基因工程技术改造pMG36e载体,成功构建出具有双筛选标记的外分泌表达纤维素酶的食品级重组质粒,完成载体构建;然后将该质粒转化到粪肠球菌19855株并实现基因表达,经测定,分泌的纤维素酶活力为0.92 U/mL。该研究结果为后续食品级工程菌的进一步研制奠定了基础。     

微生物拮抗检测方法的优化及其在秸秆发酵用菌株的应用

在利用复合菌添加剂提高青贮品质和营养价值的研究中, 首先需要确定菌株间的拮抗特性, 以便获得最佳组合效果。利用传统的1/2组合菌饼法和牛津杯法检测了6种微生物间的拮抗特性。结果显示, 仅产朊假丝酵母菌和黑曲霉菌之间存在弱拮抗现象。在后续全组合液滴法检测中不仅观察到了以上拮抗现象, 还检测到了枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母菌, 以及绿色木霉菌与黑曲霉菌之间的拮抗现象。通过显微镜观察绿色木霉菌与黑曲霉菌之间的接触区域, 进一步证实了拮抗现象的存在。在所用的6种微生物中, 乳酸菌与其他受试菌无明显拮抗, 能够与其他微生物进行复配。产朊假丝酵母菌与枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌存在拮抗, 因此, 可与乳酸菌和绿色木霉菌进行组合发酵。同样, 枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌可单独与乳酸菌进行组合使用。综上表明, 与传统的1/2组合菌饼法和牛津杯法相比, 全组合液滴法具有操作简便、接触充分、不易污染和结果全面等优点。     

马转录因子TBX3基因的密码子使用偏好性分析

为了解马TBX3基因的密码子使用特性,为选择该基因最佳的受体以及合适的异源表达系统提供依据,利用CHIPS、CUSP、Codon W等软件对NCBI公布的马TBX3基因(GenBank登录号为XM_014742147.1)的密码子使用情况进行分析,并将其与马的10个肢体生长和肢体形态形成相关基因、模式生物基因组以及其他物种TBX3基因进行比较。结果表明:马TBX3基因偏好使用G/C结尾的密码子,存在19种偏好使用的密码子(RSCU1.20),其中:GCC、CTG、AGC和GTG偏好性较强(RSCU2.00);10个马相关基因在20种偏好密码子中偏好性较强的只有CTG,17种密码子偏好G/C结尾;通过比较30种动物的TBX3基因密码子偏好性,发现其TBX3基因表达水平一般,并且密码子偏好G/C结尾;基于RSCU值和CDS序列的聚类分析发现,奇蹄目的家马与食肉目的家猫、北极熊聚在一起,可见系统进化树更接近这30个物种的真实系统分类;在密码子的使用频率上,小鼠更适合作为马TBX3基因的外源表达宿主。本研究可为TBX3基因在动物遗传育种改良中选择适合的宿主动物、筛选最佳的外源表达系统以及提高其表达水平提供依据。     

微生物青贮添加剂研究进展

青贮制备技术的发展与人类农牧历史紧密相关。青贮作为家畜尤其是反刍动物的重要饲料来源,如何充分发挥其营养价值、提升家畜生产性能,一直是动物饲料科学方面的研究热点。青贮添加剂的出现为实现这一目标提供了机遇。目前,许多种类的微生物青贮添加剂已实现商品化,并且制备开发的新型添加剂也在不断涌现。围绕现有青贮微生物添加剂的发展历史、主要类型、发展现状与发展前景等方面进行了综述,以期为进一步开发新型优良微生物添加剂提供参考。