5株H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析和豚鼠间传播能力的评估

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在哺乳动物间的传播能力,本研究以豚鼠为模型评价了5株H9N2亚型AIV在豚鼠体内的复制能力和水平传播能力,并分析了5株病毒血凝素(HA)蛋白的分子特征。结果表明,5株病毒均属于CK/Beijing谱系,其中2株病毒的HA具有人样受体特征(Lys226),2株病毒具有禽样受体特征(Gln226),而A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)株在该位点的氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe226)。裂解位点分析表明,5株病毒均具有低致病性AIV特征。个别病毒的潜在糖基化位点存在增加或缺失现象。感染试验表明,5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制。并且在鼻甲骨处复制稳定,平均病毒滴度为2.01 Log EID50/mL～4.5 Log EID50/mL。传播试验表明,所有病毒株的人工接种豚鼠的鼻洗液中均能够检测到病毒,最长排毒期为接毒后第8 d,而接触组豚鼠鼻洗液中未检测到病毒。本研究表明,5株H9N2亚型AIV均属于CK/Beijing谱系,部分病毒株的HA蛋白已具备人样受体结合特征,并且关键氨基酸位点(226位)处出现新的突变。5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制并通过上呼吸道排毒,但不能在豚鼠间同群传播。     

两株EA H1N1亚型猪流感病毒在豚鼠体内的复制和传播能力评估

为评价欧亚类禽H1N1(EA H1N1)亚型猪流感病毒(SIV)在哺乳动物间呼吸道飞沫的传播能力,本研究选取A/swine/Henan/11/2005(H1N1)(He N11)和A/swine/Hunan/26/2010(H1N1)(HuN26)为代表病毒株,以106EID50/300μL的剂量,经鼻腔分别感染3只豚鼠,24 h后在相邻笼内分别放入3只豚鼠作为传播组,通过检测鼻洗液内的病毒滴度评价2株病毒在豚鼠间呼吸道飞沫的传播能力;并以相同剂量分别感染2只豚鼠,感染72 h后通过检测脏器内病毒滴度评价2株病毒在豚鼠体内的复制能力。传播试验结果表明,HeN11株在豚鼠间的传播能力为3传1,HuN26株为3传3。脏器中病毒滴定结果表明,HeN11株在下呼吸道具有良好的复制能力,而HuN26株主要在上呼吸道复制。进一步的氨基酸差异分析表明,2株病毒株共有62个氨基酸差异。以上结果表明,2株病毒株均能够在豚鼠呼吸道内进行不同程度的复制,而呼吸道飞沫传播能力显著不同。本实验为进一步研究EA H1N1 SIV在哺乳动物间呼吸道飞沫传播的分子机制奠定基础,也为猪流感的防控提供了实验依据。     

两株H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列测定及其对小鼠的感染性研究

为了解2015年广西地区活禽市场中的两株鸡源H9亚型禽流感病毒(AIV)A/chicken/GX/S30272/2015(H9N2)(简称GX/272/15株)和A/chicken/GX/S30825/2015(H9N2)(GX/825/15株)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组序列测定和小鼠的感染性试验。核苷酸序列分析表明,两株病毒的HA基因发生了I~(155)T、H~(183)N、A~(190)T和Q~(226)L突变,这些突变与增强病毒的人源受体结合特性密切相关。遗传演化关系表明,两株病毒的HA基因均属于欧亚分支Beijing/1/94谱系。GX/272/15株的8个基因节段和GX/825/15株的HA节段来源于H9N2 AIV,GX/825/15株的其余7个基因节段分别来源于H4N2、H10N6、H7N9、H7N1、H9N2、H6N6和H3N2多种不同亚型的AIV。两株病毒均可感染小鼠,且均不需要经过适应即可在小鼠的鼻甲内进行复制。但仅GX/825/15可以在小鼠的肺脏内复制。两株病毒均未造成小鼠死亡,仅引起小鼠体重的轻微变化,对小鼠呈低致病力。本研究结果表明,H9N2亚型AIV能够感染哺乳动物,应加强后续分离病毒对人类健康危害性的评估。     

一株鸭源H10N5亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解湖北省活禽市场鸭源H10N5亚型禽流感病毒(AIV) A/duck/Hu B/S1254/2014 (H10N5)株的生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序,并以BABL/c小鼠为动物模型评价其对哺乳动物的感染性。序列分析结果显示:该病毒HA蛋白的裂解位点为334PELMQGR↓GLF343,符合低致病性AIV的特征。其表面基因HA、NA以及内部基因PB2和PA与1株江西野鸟源病毒株A/migratory duck/Jiangxi/30246/2013 (H10N5)高度同源,但其它内部基因节段PB1、NP、M和NS则来源于多个亚型的AIV。对小鼠的感染性实验结果显示,该病毒不需要提前适应就能够在小鼠的鼻甲和肺脏中有效复制,病毒滴度分别为4.08 log10 EID50/m L,5.0 log10 EID50/mL,病毒对小鼠呈低致病性,小鼠体重无显著的下降趋势,在感染期间小鼠未出现明显临床症状。本研究为了解H10N5亚型AIV分子进化关系,评估其对哺乳动物的感染风险提供了数据支持。     

一株H4亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传演化分析

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定一株H4亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(缩写为DK/GX/912/08)。为了解该株H4亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:DK/GX/912/08HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于东半球谱系的欧亚分支;NA基因与A/duck/Jiangxi/1286/2005(H5N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98.1%;PB2基因与A/duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)处于同一分支;而NS基因与A/duck/Jiangxi/1786/03(H7N7)同源性最高。因此,推测DK/GX/912/08可能是不同来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及对哺乳动物致病力研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对哺乳动物的致病力,本研究选取了2009年～2010年从我国南方地区分离到的6株H9N2 AIV,测定分析了其基因组序列及在小鼠体内的复制能力。HA基因分析显示:6株病毒均属于A/CK/BJ/94谱系,HA均含有人样受体结合位点Leu226。PB2基因分析表明,6株H9N2 AIV分离株均具有AIV低致病力的分子特征(Glu627和Asp701)。对BALB/c小鼠感染试验显示:感染组无任何临床症状及增重;病毒仅局限于小鼠呼吸道复制。本研究结果有助于全面了解近年我国H9N2 AIV分子进化情况,并对评估H9N2AIV对哺乳动物的潜在威胁提供参考。     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的遗传进化及致病性分析

为了解H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的遗传进化及致病特点,本研究对一株从健康三穗鸭体内分离鉴定的H6N6亚型AIVA/Sansui Sheldrake Duck/Guizhou/013/2014(H6N6)进行部分生物学特性测定、全基因组测序与遗传进化分析及动物感染试验。结果表明:分离株的HA裂解位点"339PQIETRG345"为非连续性的碱性氨基酸,其MDT为98.4 h,ICPI为0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST结果显示该分离株HA基因与A/chicken/Hunan/S41912/2009(H6N2)的核苷酸同源性最高(97.1%);NA基因与A/duck/Eastern China/48/2010(H6N6)的一致性最高(97.0%);而PB2基因与A/muscovy duck/Vietnam/LBM755/2014(H5N6)的同源性达96.9%,M基因和NP基因则分别与A/duck/Jiangsu/4/2010(H3N6)和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)同源性最高。动物感染试验结果表明,感染鸭不表现明显的临床症状,咽喉和泄殖腔不存在排毒现象;鸭子感染后的第3 d、5 d及7 d部分组织脏器中可以检测到病毒复制,但病毒含量并不高。以上研究结果表明,贵州省内分离到的H6N6亚型AIV是一株弱毒株,其基因组可能是由H6N2、H5N6、H3N6、H5N1等多个亚型病毒重组而成。     

一株H6N6亚型野鸟禽流感病毒全基因组序列分析以及对小鼠的感染性研究

为进一步了解2015年分离于我国新疆野鸟粪便中的一株H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/WB/XJ/S1541/2015(H6N6)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组测序、遗传演化分析以及BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析结果显示:该分离株HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为~(339)PQIETR↓GL~(346),仅有1个碱性氨基酸,具有低致病性AIV的分子特征。此外,分离株表面基因HA、NA均与一株H6N6亚型猪流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010高度同源,而内部基因均与H6N6亚型AIV A/pigeon/Guangxi/161/2014(H6N6)高度同源,提示该分离株基因来源的多样性。小鼠的感染性试验结果显示:该病毒可在小鼠的肺脏和鼻甲中有效复制,病毒滴度分别为5.33 log_(10) EID_(50)/mL、4.50 log10EID50/m L,提示其具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究结果为H6亚型AIV的持续性监测和相关生物学特性的研究奠定基础。     

1株H6N6亚型禽流感病毒贵州分离株HA和NA基因克隆与序列分析

为了解 H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的流行情况,本研究对2014年从贵州省三穗鸭体内分离鉴定出的1株H6N6亚型AIV (A/duck/Guizhou/013/2014) HA和NA基因进行了克隆和序列分析。结果显示,A/duck/Guizhou/013/2014的HA基因与华东地区2009年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达97.5%,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性AIV的分子特征;而NA基因则与福建2007年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达98.2%;由遗传进化树分析结果可知,HA和NA基因在遗传进化关系上,与湖南毒株位于同一分支,而与2007年贵州分离的3株H6N6亚型AIV不处于同一分支,说明A/duck/Guizhou/013/2014与本地区的H6N6亚型AIV亲缘关系较远。本研究结果表明当前贵州地区H6N6亚型AIV存在明显的遗传多样性。     

两株鸭源H6N2亚型禽流感病毒的序列分析及对鸡的致病性研究

为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV [A/duck/Hube/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验.序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我国近年流行的H6亚型病毒株,但是HB/061/08株的内部基因可能来源于H9、H5等其他亚型.与病毒株HB/061/08 NP、PA、PB2基因的核苷酸同源性最高的病毒株为A/environment/Hunan/2-84/2007(H9N2);与M、PB1和NS基因的核苷酸同源性最高的病毒株分别为A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)、A/chicken/Hebei/7/2008(H9N2)和A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2).两株病毒的抗原差异性较显著,相关系数为0.49;用106 EID50病毒剂量感染4周龄SPF鸡,结果显示FJ/080/09株不能感染鸡,而HB/061/08株在鸡体内能够高效复制,并通过咽喉和泄殖腔持续排毒.鸡群感染后第3d采取脏器样品,在气管和肺部能够检测到病毒存在,部分脏器和器官的组织学观察显示存在一定程度的病理变化.以上数据表明,H6亚型AIV在跨越不同宿主感染的传播过程中,对新宿主适应能力的差异导致对其致病性的差异.     

鸭甲肝病毒GX株全基因组序列测定及VP1蛋白生物信息学分析

为探讨鸭甲肝病毒(DHAV)GX株基因分型特点及主要衣壳蛋白(VP1)的生物学特性,本试验对其进行全基因组序列测定,并应用分子生物学软件将DHAV GX株与DHAV 3个血清型参考毒株进行序列比对分析。结果显示,其基因组全长7 800 bp,由5'和3'非编码区(UTR)和一个大开放阅读框(ORF)组成。其中,5'UTR和3'UTR的长度分别为652和369 bp;ORF长度为6 756 bp,编码2 251个氨基酸长的多聚蛋白,其编码产物至少有12个(VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D);在分类地位上DHAV GX株属于DHAV-3,其与DHAV-3参考株核苷酸、氨基酸同源性最高;与DHAV-3 FS株亲缘关系最近,在同一较小分支上。DHAV GX株结构蛋白VP1以第195—201、211—221位氨基酸区段为B细胞优势表位的可能性较大。提示,VP1基因可作为研制DHAV基因工程疫苗的优势候选基因。     

Determination of the Complete Genome of DHAV GX Strain and Bioinformatics Analysis of VP1 Protein

In order to investigate the genotypic characteristics and biological characteristics of major capsid protein (VP1) of duck hepatitis A virus (DHAV) GX strain, the whole genome of GX strain was sequenced and compared with 3 serotypes reference strains of DHAV by the molecular biology software.The results showed that the full-length genome of DHAV GX strain was 7 800 bp, including 5'UTR (652 bp), 3'UTR (369 bp) and ORF (6 756 bp) encoding 2 251 aa and its coding products were 12 (VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D) at least.Sequence analysis showed that DHAV GX strain could be ranked DHAV 3 style.This strain shared the highest homology with DHAV-3 reference strains; Furthermore, GX strain and DHAV-3 FS strain were in the same cluster, might come from the same ancestor.Amino acid segments locating in 195 to 201 and 211 to 221 aa could be larvaceous dominant B-cell linear epitopes.It suggested that VP1 gene could be used as a candidate gene for the development of genetic engineering vaccine of DHAV.     

Cloning and Sequence Analysis of P97 Gene R1 Region of Mycoplasma hyopneumoniae in Guangxi Luchuan Pig

Through in-depth understanding of sequence characteristics, structure and genetic variation of adhesion factor P97 gene R1 region of Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) epidemic strains in Guangxi Luchuan pig, the assay was aimed to provide theoretical basis for mycoplasmal pneumonia of swine (MPS) integrated effective prevention and control measures of Guangxi local variety Luchuan pig, and lay a solid foundation for further study the characteristics of Mhp epidemic strains in Guangxi Luchuan pig.A pair of primers was designed to amplify P97 gene R1 region according to Mhp genome sequence, the MPS positive disease materials of Guangxi Luchuan pig from 2011 to 2014 as the object of study, after genomic DNA extraction and PCR amplification of P97 gene R1 region, the PCR products were sequenced.The base composition and deduced amino acid sequence of P97 gene R1 region of Mhp epidemic strains of Guangxi Luchuan pig were compared.The analysis of DNAStar showed that there were multiple base mutations in P97 gene R1 region of 15 strains of Guangxi Luchuan pig Mhp strains (GXLC-1, GXLC-2, GXLC-3, GXLC-4, GXLC-5, GXLC-6, GXLC-7, GXLC-8, GXLC-9, GXLC-10, GXLC-11, GXLC-12, GXLC-13, GXLC-14 and GXLC-15) and 3 strains of Guangxi other breeds of pigs Mhp strains (GX227, GX595 and GX674).The statistical repeat number of five amino acid (AAKPV/E) of P97 R1 region were 9 to 18, the average value was 12, TN repeats were 1 to 4.We found that Guangxi Luchuan pig Mhp strains mutation made its virulence and adhesion ability enhancement, and respiratory of Luchuan pig with the special structure of short and narrow, which could more easily lead to the occurrence of Guangxi Luchuan pig MPS.     

广西陆川猪猪肺炎支原体P97基因R1区克隆及序列分析

本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体(Mhp)地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎(MPS)有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以 2011年-2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株(GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15)和3株广西其他品种猪Mhp毒株(GX227、GX595、GX674)的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97 R1区五氨基酸(AAKPV/E)重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。     

一株鸭源基因IX型新城疫病毒广西分离株的生物学特性及全基因序列分析

为全面了解广西分离株GX19／2011的生物学和遗传特性,对分离株的鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）、6周龄鸡胚静脉接种致病指数（IVPI）和对鸭的致病力进行测定,并对其全基因遗传特性进行研究研究。结果显示：该分离株的ELD50为10-9.48/0．1mL、MDT为51．4h、ICPI为1．80、IVPI为2．82。使用该毒株分别感染35日龄和50日龄的鸭,发病率均为100％,死亡率分别为100％,70％。该毒株全长为15192bp,与F48E8和GD09-2等参考毒株的亲缘关系较近,均属于基因IX型。该分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为11R-R-Q-R-R-F117,具有强毒株的典型特征。生物学特性和遗传进化分析结果都表明该毒株为速发型强毒株,同时对鸭具有较强的致病力。     

H3N2亚型禽流感病毒及猪流感病毒感染人肺腺癌细胞后增殖的差异性变化

人肺腺癌细胞A549被H3N2亚型禽流感病毒和猪流感病毒感染后,探讨不同毒株跨种属感染人呼吸道组织的可能性和趋势性。通过观察病毒感染A549细胞后的细胞病变(CPE)、血凝试验(HA)和50%组织细胞感染量(TCID50)来比较不同毒株感染细胞后的复制差异和毒力改变,发现同一亚型不同来源的流感病毒对A549细胞感染和复制能力有较大差异,哺乳动物来源的病毒更有感染人呼吸道细胞的趋势,SW/GX/NS2783/2010有潜在的感染人细胞的能力。感染过程中的细胞因子变化和病毒基因组组成特点是进一步研究的方向,应重点关注具有跨种属感染趋势的流感病毒及其特殊分子决定簇的组成和特点。     

Characterization of parainfluenza type 3 virus isolated from the lung of a lamb with pneumonia

A virus designated DH-1 was isolated from the lung of a lamb that died during the course of an epizootic of acute respiratory tract disease. The virus contained ribonucleic acid and was sensitive to heat (56 C), lipid solvent, and acid (pH 3.0). Inoculated cell cultures absorbed and culture fluids agglutinated guinea pig erythrocytes. Morphogenic and morphologic characteristics of the isolate were compatible with those of the genus Paramyxovirus of the family Paramyxoviridae. Serologic results indicated that the virus was indistinguishable from prototype parainfluenza virus type 3.     

Antibody-mediated resistance against duck enteritis virus infection.

Vaccination of ducks with an apathogenic strain of duck enteritis virus resulted in protection against challenge with the virulent Lake Andes strain of duck enteritis virus by intramuscular inoculation or contact exposure. Antisera produced in the vaccinated ducks were able to transfer resistance against the challenge strain to recipient ducks. Antisera against duck enteritis virus were cytotoxic for duck enteritis virus-infected duck embryo fibroblasts in the presence of guinea pig complement. These in vivo and in vitro data suggest that the humoral immune mechanism plays a role in protecting ducks from duck enteritis virus infection.     

1株野鸭源H6N2亚型AIV对SPF鸭的致病性

本研究选取2周龄SPF鸭（绍兴麻鸭）自天然孔感染1株野鸭源H6N2亚型LPAIV,评价其对幼龄鸭的致病性。结果显示,试验感染鸭临床症状较轻微,病毒在鸭消化道复制能力较呼吸道内更强,且具有水平传播的能力。仅能在盲肠扁桃体和法氏囊2个组织器官中检测到病毒,但可对法氏囊等多个组织器官造成不同程度的损伤。此外感染鸭可产生HI抗体,并在第21天达到高峰。结果表明,该株H6N2亚型LPAIV对幼龄鸭的致病力较低,在AIV病毒传播中幼龄鸭起到了一定作用,为研究H6N2亚型LPAIV的致病机制及AIV发病机理提供了理论数据。