猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.     

二株广西猪繁殖与呼吸综合征流行毒M基因的克隆和序列分析

广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致.利用针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从广西贵港市(GXGG)和南宁市(GXNN)收集到的可疑病料进行检测,结果两份为阳性.合成针对M基因的引物M1和M2,分别扩增了GXGG和GXNN两株PRRSV的M基因,并进行克隆和测序,得到长582个核苷酸的目的基因片段.应用DNAStar序列分析软件对所测的两个广西毒株与国内外已发表的ATCC VR-2332、LV和CH-la毒株进行同源性比较.分析表明,GXGG与ATCC VR-2332、LV、CH-la的核苷酸同源性分别为95.6%、69.5%、97.7%;GXNN与ATCC VR-2332、LV、CH-la的核酸同源性分别为94.9%、69.5%、97.3%.对推定的氨基酸序列进行了比较,GXGG与ATCC VR-2332、LV、CH-la的氨基酸同源性分别为97.7%、80.5%、97.7%;GXNN与ATCC VR-2332、LV、CH-la的氨基酸同源性分别为98.3%、79.9%、97.1%.说明广西流行毒株与ATCC VR-2332和CH-la的同源性很高,而与LV毒株的同源性很低.从本研究构建的系统发育树分析,广西流行的PRRSV与ATCC VR-2332株的亲缘关系比较密切.     

江西PRRS流行毒株ORF7基因遗传变异分析

江西某4个猪场发生以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状等为特征的传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致.本研究对送检病料进行RT-PCR检测为阳性后,克隆出PRRSV ORF7基因,序列分析表明4个序列之间同源性是98.7%～100%,同源性很高;与美洲型蓝耳病标准毒株VR-2332的同源性为93.3%～94.6%,与疫苗株MLV的序列同源性在93.3%～94.6%;而与欧洲株LV的同源性只有58.1%～58.6%.结果表明这4个毒株与VR-2332和MLV株亲缘关系比较密切,属于美洲型毒株.     

PRRSV辽宁株N蛋白基因的克隆及序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因全长cDNA,结果表明,该分离株N基因cDNA编码区长372bp,可编码123个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,核苷酸同源性分别为92.2%和27.2%,推测该辽宁分离株属于美洲型。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株E11105 N基因的序列分析与原核表达

为研究PRRSV N蛋白的结构、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用,以临床分离PRRSV毒株E11105为研究对象,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,经RT-PCR扩增出N基因片段,利用相关分子生物学软件对N基因序列进行分析;将N基因克隆连接到pColdⅠ原核表达载体上,经PCR、双酶切鉴定及序列测定后,得到重组质粒pColdⅠ-N,将pColdⅠ-N转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证分析。结果显示,分离株E11105N基因与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%,氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%;系统进化树显示,E11105株N基因与美洲型代表株VR-2332、中国高致病性JXA1毒株的亲缘关系较近;分离株E11105N基因所编码蛋白不存在跨膜区;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占20.33%和63.41%;预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明,重组N蛋白主要存在于菌体沉淀中,分子质量约为16.7ku;Western blot结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单克隆抗体识别,显色后条带约为16.7ku,与SDS-PAGE蛋白电泳的条带大小一致。     

我国南方某省猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株分子流行病学分析

根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332的基因序列设计并合成了一对针对ORF5基因的引物,通过RT-PCR方法对我国南方某省部分地区分离的14个PRRSV分离株进行扩增,获得了大约773bp的DNA片断,将目的片断与pMD18-T载体进行连接并测序。应用DNAStar分析所测序列,并与LV、VR-2332、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2、JX-1等毒株的序列进行比较。核苷酸序列分析表明:14株病毒的与JX-1ORF5基因同源性高达99.0%～99.8%,与CH-1a、HB-1、HB-2同源性达到91.4%～94.9%,与VR-2332、BJ-4同源性达到86.1%～87.6%,与LV同源性仅为55.2%～55.7%。氨基酸序列分析表明:与JX-1同源性高达97.5%～99%;与VR-2332、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2同源性达到85.6%～94.5%;与LV同源性仅为55.7%～56.2%。可知这14株病毒与JX-1遗传关系较近,可归属同一基因亚群。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCMS株MN蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的美洲株ATCC VR-2332的MN蛋白基因序列,利用Oligo6.0设计一对特异性引物,以抽提的PRRSV-SCMS病毒感染细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出长约1.0 kb的基因片段,将其克隆入pMD 18-T载体,测序结果显示SCMS MN基因全长886 bp,包含完整的MN基因的开放阅读框,共编码297个氨基酸。PRRSV-SCMS MN基因序列与VR2332和LV株进行同源性分析结果显示,PRRSV-SCMS与VR2332和LV株之间的核苷酸序列同源性分别为99.7%和61.6%,根据M基因推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和78.7%,根据N基因推导的氨基酸序列同源性分别为100%和52.8%。结果表明,SCMS地方分离株与VR2332株在基因型上具有更近的亲缘关系,推测本次分离的PRRSV属于美洲型。     

辽宁省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株ORF5-7基因遗传变异分析

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332全基因序列,设计并合成2对引物,采用RT-PCR技术,对辽宁省站送检的病料进行分离扩增,分别获得相应的目的片段,将其分别克隆入pMD18-T载体中,并送上海生工测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332、CH-1a、BJ-4、LV-M96262及疫苗株的ORF567基因进行序列比较,通过核苷酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为89.5%～95%,与LV-M96262的同源性为54%～58.3%.氨基酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为82.8%～94.7%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF5基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得5个ORF5基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果表明,5个ORF5基因序列之间核苷酸同源性为97.7%～98.5%,与欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR-2332、2006—2007年国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)、2006年以前中国分离毒株(CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh))和2个疫苗株(Resp PRRS MLV、MLV RespPRRS/Repro)核苷酸同源性分别为63.5%～64.0%、88.7%～89.2%、97.7%～99.3%、88.1%～96.7%和88.6%～89.1%;氨基酸同源性分别为56.1%～56.6%、87.8%～88.8%、96.6%～98.5%、85.9%～93.2%、86.8%～87.9%。结果表明山西地区的PRRSV流行毒株均属于美洲型,且毒株同源性很高,亲缘关系紧密。     

我国部分省区HP-PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV ) JXA1的ORF5基因序列,设计并合成了一对引物,对分离自云南、浙江、山东、辽宁、黑龙江、天津、湖南等7省12株PRRSV分离株进行RT-PCR扩增,获得约773 bp的DNA片段,将其分别克隆至pGEM-T Easy载体中,并进行测序.应用DNAStar软件分析序列,并与VR-2332、CH-la、MLV、LV、BJ4、HB1、HuB2、JXA1等毒株ORF5序列进行比较,结果表明,分离株间的核苷酸同源性为91.9%～100%,氨基酸同源性为90.1%～100%;在美洲株遗传关系上又分为明显的2个群:12株分离株与HB1、HuB2、JXA1、CH-la亲缘关系比较近,处于一个亚群;VR-2332、MLV、BJ4处于另一个亚群.说明高致病PRRSV为我国PRRS主要流行病毒.     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PKRSV）ATCC VR-2332的ORF5基因序列，设计并合成了一对引物．对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增．获得约748bp的DNA片断，将其分别克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332、CH-1a、MLV、Lv等毒株的ORF5序列进行比较，结果表明：SHDl与F114、MLV、ATCCVR-2332同源性高达98．5％，与CH-1a同源性为91．0％，与其它毒株同源性为86．6％~88．4％；F114与MLV、ATCCVR-2332同源性为99．3％～99．7％．其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群．显示近年来各地PRRSV分离毒株与cH-1a株的遗传差异越来越大。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GZZJ201711株全基因组序列分析

为了解贵州省毕节地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,于2017年从贵州毕节地区某疑似感染PRRSV猪群分离到1株PRRSV,将其命名为GZZJ201711毒株。采用RT-PCR分段扩增出PRRSV GZZJ201711株13个基因片段,分别连接到pMD19-T载体上进行测序,拼接后得到PRRSV GZZJ201711株全基因组长15 322 bp (去除polyA尾),包括5’UTR、ORFla-ORF7、3’UTR。序列分析表明,GZZJ201711株与欧洲型Lelystad virus(LV)株核苷酸同源性为60.3%,与美洲型毒株代表株ATCC VR-2332核苷酸同源性为89.2%,与HP-PRRSV(HUN4、JXA1、TJ)等毒株同源性在98.8%~98.9%之间。GZZJ201711株与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJ属于同一小分支,其中与XJu-1、GDHY毒株遗传关系最近。GZZJ201711毒株的NSP2基因有30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、TJ等HP-PRRSV毒株缺失位置一致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株NSP2基因的序列分析

为了分析河北省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的变异情况,试验对2009年采自秦唐部分地区和廊坊地区的临床发病猪肺组织提取RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的NSP2全序列,并对其进行生物信息学分析,应用DNAStar软件将其与VR-2332、CH-la、MLV、BJ-4、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株进行序列比对。结果表明:河北地方株NSP2基因全长2 850 bp,编码的氨基酸均缺失30个不连续的氨基酸;其与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病毒株亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远。     

两株猪繁殖与呼吸征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

从广东省发病猪场采集的组织和血清中分离到两株PRRSV,病料经RT-PCR检测为阳性,通过Marc-145细胞进行传代,可产生明显细胞病变,通过间接免疫荧光可检测到荧光信号,两株病毒分别命名为ZH-GD株和ZS-GD株。对两株病毒的ORF5和Nsp2高变区进行序列测定和分析,结果表明,PRRSV ZH-GD株和ZS-GD株的核苷酸序列与欧洲型代表株LV株间的相似性相对较远,与美洲株经典毒株VR-2332间的相似性分别为88.6%和88.1%,与中国经典美洲毒株CH-1a间的相似性分别为94.4%和93.0%。在Nsp2上有30个氨基酸的缺失,与JXA1、XH-GD等高致病性变异株的Nsp2缺失位置一致。分离的两株PRRSV均属于美洲型的变异株PRRSV。