猪TRIM3基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】克隆大白猪三基序结合蛋白3（tripartite motif-containing 3,TRIM3）基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。【方法】采用PCR技术扩增并克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选阳性克隆,菌液PCR鉴定后测序,与不同物种TRIM3基因序列比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对其编码蛋白进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测TRIM3基因在大白猪不同组织中的相对表达量。【结果】大白猪TRIM3基因CDS序列全长2 235 bp,编码744个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,大白猪与野猪的相似性最高,达99.7%,与鸭的相似性最低,为75.1%;大白猪TRIM3基因与野猪先聚为一类,与牛和山羊亲缘关系较近。生物信息学分析显示,大白猪TRIM3蛋白分子质量为80.58 ku,理论等电点（pI）为8.32,不稳定系数为40.85,为亲水性蛋白,但不是分泌蛋白,无糖基化位点,预测其有60个磷酸化位点,主要存在于细胞质内;在TRIM3蛋白二级结构中以无规则卷曲为主,占41.67%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。组织表达分析表明,大白猪TRIM3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、气管、结肠中均有分布,肺脏中表达量最多且显著高于其他组织（P＜0.05）。【结论】本研究成功克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,并进行了生物信息学和组织表达分析,为进一步研究大白猪TRIM3蛋白的免疫学功能提供理论依据,对探究大白猪TRIM3基因参与先天性免疫和抗病毒感染分子机制具有重要意义。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

口蹄疫病毒P12X3C3D多基因编码蛋白在昆虫细胞中的表达与检测

利用杆状病毒表达系统构建了包含有口蹄疫病毒（FMDV）P12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒。将该病毒感染Sf9细胞后，利用SDS—PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明，重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白，该表达产物能被FMDV阳性血清识别，具有一定的反应原性。     

2种锌源对体外培养胸腺细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达的影响

采用地噻咪松作为诱导剂,建立小鼠胸腺细胞体外培养的凋亡模型,培养基中分别补加1 000μmol/L的硫酸锌或蛋氨酸锌,培养16 h.测定细胞的凋亡率、DNA片段化以及Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达量.结果表明,地噻咪松显著提高体外培养腺细胞凋亡(P＜0.01),并上调Bcl-2、Bax、Caspase-3 3种基因的mRNA表达(P＜0.01).硫酸锌和蛋氨酸锌对地噻咪松诱导的凋亡均有显著的抑制作用(P＜0.01),并对上述3种基因表达的上调有抑制作用(P＜0.01).蛋氨酸锌处理的细胞凋亡率及Caspase-3 mRNA表达均高于硫酸锌处理,Caspase-3mRNA表达量差异达到了显著水平(P＜0.05).这表明,锌调控糖皮质激素诱导的细胞凋亡涉及到对基因转录水平的调节,2种锌源在一定程度上存在着差异.     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。     

蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。     

Restoration of the adipogenic gene expression by naringenin and naringin in 3T3-L1 adipocytes

BackgroundNaringenin and its glycoside naringin are well known citrus flavonoids with several therapeutic benefits. Although the anti-adipogenic effects of naringenin and naringin have been reported previously, the detailed mechanism underlying their anti-adipogenesis effects is poorly understood.ObjectivesThis study examined the anti-adipogenic effects of naringenin and naringin by determining differential gene expression patterns in these flavonoids-treated 3T3-L1 adipocytes.MethodsLipid accumulation and triglyceride (TG) content were determined by Oil red O staining and TG assay. Glucose uptake was measured using a 2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-d-glucose fluorescent d-glucose analog. The phosphorylation levels of AMP-activated protein kinase (AMPK) and acetyl Co-A carboxylase (ACC) were observed via Western blot analysis. Differential gene expressions in 3T3-L1 adipocytes were evaluated via RNA sequencing analysis.ResultsNaringenin and naringin inhibited both lipid accumulation and TG content, increased phosphorylation levels of both AMPK and ACC and decreased the expression level of 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase (HMGCR) in 3T3-L1 adipocytes. RNA sequencing analysis revealed that 32 up-regulated (> 2-fold) and 17 down-regulated (< 0.6-fold) genes related to lipid metabolism, including Acaca, Fasn, Scd1, Mogat1, Dgat, Lipin1, Cpt1a, and Lepr, were normalized to the control level in naringenin-treated adipocytes. In addition, 25 up-regulated (> 2-fold) and 25 down-regulated (< 0.6-fold) genes related to lipid metabolism, including Acaca, Fasn, Fabp5, Scd1, Srebf1, Hmgcs1, Cpt1c, Lepr, and Lrp1, were normalized to the control level by naringin.ConclusionsThe results indicate that naringenin and naringin have anti-adipogenic potentials that are achieved by normalizing the expression levels of lipid metabolism-related genes that were perturbed in differentiated 3T3-L1 cells.     

草原红牛ACSL3基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在克隆草原红牛长链酰基辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)基因编码区并对其进行生物信息学分析,同时在mRNA和蛋白质水平上分析ACSL3基因在草原红牛不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术和TA克隆的方法获得草原红牛ACSL3基因CDS序列;利用在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,分析ACSL3基因与其他物种的同源性并构建系统进化树,分析ACSL3基因编码蛋白质的基本理化性质、潜在磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、信号肽、二硫键、跨膜区结构、亚细胞定位及该基因编码蛋白的二级结构、三级结构;通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测ACSL3基因在草原红牛各组织间的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,试验成功克隆了草原红牛ACSL3基因CDS区,全长2 163 bp,编码720个氨基酸,蛋白分子质量为80.28 ku,理论等电点为8.74,属于亲水性蛋白。通过NCBI中BLAST比对发现,草原红牛与牛、绵羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡的ACSL3基因核苷酸序列同源性分别为99%、97%、93%、91%、88%、88%和78%;系统进化树结果表明,草原红牛与牛、绵羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。该蛋白序列有7个二硫键,66个磷酸化位点,9个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,不存在信号肽,但存在1个跨膜区。二级结构和三级结构分析结果表明,ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接,蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主,为混合型蛋白。mRNA和蛋白表达量检测结果显示,ACSL3基因在肾脏和肌肉组织中表达量较高,显著高于其他组织(P<0.05);在胃、肝脏和心脏中中度表达,显著高于脾脏、肺脏、肠和脂肪(P<0.05);在脾脏、肺脏、肠和脂肪中相对低表达,说明草原红牛ACSL3基因可能与体内脂肪沉积和脂质代谢等调控功能有关。本试验结果为进一步研究ACSL3基因在草原红牛中脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供了基础材料。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达

设计、合成FMDV非结构蛋白3B基因的PCR引物，并在引物5’端和3’端分别加入含BamH I和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组PNA为模板，利用RT—PCR技术扩增3B基因，得到的基因片段经BamH I/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBAC HTa连接，转化宿主菌DH10BAC，在含庆大霉索、卡那霉索、X-gal、IPTC的LB平板上37℃培养24h，提取白色菌落，从中提取重组Bacmid 3B，与脂质体共同转染昆虫细胞8f9，得到重组杆状病毒，病毒经传代扩增后感染High5细胞，表达目的蛋白——FMDV非结构蛋白3B。SBS-PAGE及Westem Blot结果显示，本研究成功构建了Bacmid-3B重组表达载体，并在昆虫细胞中表达了NSP—3B蛋白，该表达产物可与MDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。     

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究.首先克隆了3D基因片段,将pMD18-3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及Xba Ⅰ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-3D;再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3D;将Bacmid-3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测.经SDS-PAGE和West-ern blot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达.     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

布鲁菌IF3蛋白的原核表达及鉴定

布鲁菌病是由细胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌布鲁菌引起的一种人兽共患病,以发热、流产为主要症状,严重威胁着人畜健康.以布鲁菌M16基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增出537 bp的布鲁菌IF3蛋白编码基因,并克隆至原核表达载体pET32a( ),成功构建了pET32a-IF3重组质粒,经IPTG诱导,证实目的蛋白以可溶性形式高效表达,利用离子交换层析纯化重组蛋白,纯度可达95%,免疫印迹显示,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为布鲁菌病的诊断和新型疫苗研究奠定了基础.     

NLRP3炎症复合体的体外构建

为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。     

绵羊EYA3基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系

为探究绵羊EYA3基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系,本实验通过采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测EYA3基因在常年发情绵羊(小尾寒羊)和季节性发情绵羊(苏尼特羊)的大脑、下丘脑和垂体组织中的表达情况,同时利用Sequenom MassARRAY~?SNP技术检测2组绵羊(常年发情组:小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊;季节性发情组:滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)EYA3基因SNP位点(g.238191128G>C)的多态性,并与绵羊季节性发情性状进行关联分析。结果表明:无论在小尾寒羊还是苏尼特羊,EYA3基因在各组织中均广泛表达,在苏尼特羊垂体中表达较高(P<0.01);且长光照条件下季节性发情的苏尼特羊垂体中EYA3基因表达量显著高于小尾寒羊(P<0.01)。绵羊EYA3基因g.238191128G>C位点均存在GG、GC和CC3种基因型。g.238191128G>C位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊中表现为低度多态(PIC<0.25);在小尾寒羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊5个群体中均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05);并且该位点基因型频率和等位基因频率在常年发情和季节性发情绵羊组间差异均达到极显著水平(P<0.01)。综上,EYA3基因表达与g.238191128G>C位点与绵羊季节性发情性状存在一定关联。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。     

小鹅瘟病毒VP3基因的原核表达

根据GenBank已发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计并合成1对特异性引物,经PCR扩增得到了1 457 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-VP3.经0.1 mmol/L IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到表达.Western-blot分析表明,该蛋白具有良好的反应原性.为开发相应的基因工程疫苗奠定了理论基础.     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

Expression and functional analysis of the Follistatin-like 3 (FSTL3) gene in the sheep ovary during the oestrous cycle

Follistatin-like 3 (FSTL3) is a regulator of cellular apoptosis and was previously identified via RNA-Seq to be associated with follicular development in mammalian ovaries. However, the mechanism underlying the FSTL3 regulation of oestrus in sheep remained poorly understood. In this study, the oestrogen (E2) and progesterone (P4) concentrations in blood were detected, and the expression level and functional analysis of FSTL3 in the ovary were studied during the different reproductive stage in Aohan fine wool sheep (seasonal breeding breed in China). The concentrations of E2 and P4 at the anestrus were significantly lower compared to dioestrus, proestrus and oestrus stages. Higher expression levels of FSTL3 were observed in the sheep ovary, hypothalamus, and thyroid. During different reproductive stages, higher expression levels were found during the stages of dioestrus and proestrus, while lower levels were found during the oestrus and anestrus stages. Functional analysis of FSTL3 was performed in primary granulosa cells (GCs) of sheep. The concentration of E2 increased significantly after RNAi interference of FSTL3, while the P4 level decreased. FSTL3 can decrease P4 levels, which might be involved in mediating oestrous cycle in sheep.