牛肠道病毒VP2基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

应用RT-PCR方法扩增牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)VP2基因,构建重组质粒pET32a(+)-VP2。转化大肠杆菌菌株BL21,IPTG诱导其表达VP2融合蛋白,Western-blot检测目的蛋白。将纯化的重组蛋白(pET32a(+)-VP2)免疫新西兰大白兔,制备VP2多克隆抗体,iELISA方法检测抗体效价,同时利用血清中和试验评估其诱导中和抗体的能力。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白的相对分子质量为50 000,与预期值大小相符;iELISA检测其抗体效价为1∶25 600;血清中和试验表明,原核表达的VP2蛋白诱导产生的中和抗体效价为1∶107.4。结果表明,成功克隆和表达了具有免疫原性的VP2蛋白,其可诱导产生较高效价的多克隆抗体,为BEV血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

鸡CD40L基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了研究鸡CD40L作为分子免疫佐剂的免疫原性,试验采用鸡的脾脏细胞克隆鸡CD40L基因,构建表达载体pET28a-cCD40L进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫长耳白兔,获得兔抗鸡CD40L多克隆抗体,用间接ELISA检测多克隆抗体效价,并进行Western-blot检测。结果表明:获得分子质量为26 ku的重组融合蛋白,多克隆抗体效价为1∶12 800;表达的融合蛋白不仅能与鼠抗His克隆抗体发生特异性反应,而且与获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体发生特异性反应。说明鸡CD40L融合蛋白具有较高的反应活性,所获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体具有良好的特异性。     

犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定

本研究旨在对犬瘟热病毒(CDV)疫苗株H基因进行克隆及原核表达,并对产物的免疫原性做初步鉴定。根据犬瘟热病毒参考株Ondetstepoort的H基因序列,去除信号肽序列并选取其主要抗原表位设计引物,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段;产物克隆至表达载体pET28b并转化宿主菌Rosetta^TM,优化诱导表达条件,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定、Western blotting分析及间接酶联免疫吸附试验(ELISA);并将纯化的H蛋白免疫小鼠,进行中和试验检测抗体效价。结果显示,PCR扩增得到1113 bp DNA片段;在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG诱导条件下可获得较高水平的表达;经SDS-PAGE鉴定,表达的H蛋白分子质量为42.38 ku,与预期值相符;Western blotting显示,在42.38 ku出现特异性目的条带;ELISA结果显示,表达的H蛋白能被抗CDV抗体识别,但与正常血清未发生非特异性反应;中和试验结果表明,血清中和抗体效价约为2^－3.3。结果提示,H蛋白获得了正确表达,对CDV抗血清具有特异反应性,可作为实时检测动物机体免疫状况检测的候选抗原,为进一步研制犬瘟热抗体检测ELISA试剂盒和新型疫苗奠定基础。     

猪圆环病毒3型Rep蛋白的表达与多克隆抗体制备

为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Rep基因在大肠杆菌中表达产物的反应原性和免疫原性,本试验对Rep基因进行原核表达和纯化,鉴定表达产物与PCV3阳性血清的反应性;制备重组Rep蛋白的多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体与重组Rep蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,Rep在大肠杆菌中获得大量表达,且主要以包涵体形式存在,重组蛋白相对分子质量约为32 000,经纯化后得到单一条带。表达的重组Rep蛋白可以与PCV3阳性血清发生反应。制备的大鼠抗Rep血清与表达的重组Rep蛋白发生特异性反应,且效价大于1∶32 000。表明本试验表达的Rep具有良好的免疫原性和反应原性,为PCV3的ELISA诊断试剂盒研制提供依据。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N蛋白的抗原性，为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，经诱导表达获得重组N蛋白，纯化后经Western blot方法检测其反应原性，免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示：重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量，该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达；Western blot结果显示，纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合，具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示：PDCoV N蛋白抗原性好，可作为诊断试剂盒的候选抗原。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

试验旨在制备犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）VP2蛋白多克隆抗体。构建pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备VP2蛋白多克隆抗体;采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。结果表明,重组VP2蛋白（rVP2）以包涵体形式存在,分子质量约为72 ku;所制备的多克隆抗体滴度为1 600倍,病毒滴度为10⁷ TCID₅₀ /mL,中和效价为1∶2 884,该抗体与体外培养的CPV呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1∶32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

国内流行犬瘟热病毒DNA重组疫苗的初步研究

为了探究H蛋白的免疫原性以及抗体效价,构建了1株犬瘟热病毒(CDV)ZH-10株H基因的真核表达载体pCI-H,对表达产物的免疫原性进行了初步研究,并进行了小鼠的DNA免疫试验。结果显示,pCI-H免疫组血清可与感染病毒的MDCK细胞发生特异性IPMA反应呈现特异的棕红色;ELISA血清抗体滴度可达1:28~1:79;病毒中和抗体可达1:11~1:32。研究结果表明,H蛋白具有免疫原性,但诱导抗体效价不足,需进一步完善。     

针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较

GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。     

犬Ⅰ型腺病毒结构蛋白Knob的可溶性表达及免疫原性研究

为了探究犬Ⅰ型腺病毒(Canine adenovirus type 1, CAdV-1)F1301株结构蛋白Knob的免疫原性,试验采用原核表达技术将Knob蛋白基因克隆到pColdⅡ原核表达载体中进行低温诱导,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中实现可溶性表达。利用纯化后的重组蛋白Knob免疫Balb/c小鼠,监测免疫后小鼠血清中重组蛋白Knob特异性抗体ELISA效价、病毒中和抗体效价,测定脾脏T淋巴细胞增殖活性,研究重组蛋白Knob的免疫原性。结果表明:表达的重组蛋白Knob为可溶性蛋白,分子质量约为20 ku。第2次免疫后7,14天,试验组小鼠血清ELISA抗体效价分别为1∶6 400和1∶3 200,中和抗体效价分别为1∶118和1∶96。第2次免疫后7天,试验组小鼠T淋巴细胞增殖指数为1.322,显著高于对照组(P0.05)。说明试验成功表达出CAdV-1重组蛋白Knob,所表达的重组蛋白Knob具有良好的免疫原性且存在CAdV-1的中和抗原表位。     

人PrP多克隆抗体的制备及鉴定

制备PrP(prion protein)多克隆抗体,验证原核表达的人PrP的抗原性,为PrP空间构象的转变机制等深层次的研究以及人PrP单克隆抗体的制备提供重要的试验材料.以融合的人成熟PrP蛋白(mature prion protein,mPrP)为抗原,以pET30a(+)空载体的E.coli BL21 (DE3)的菌体蛋白作为对照免疫原,免疫小鼠.ELISA和Western blot分别检测多克隆抗体的效价和特异性.结果5只动物中3只均产生了较高效价的抗血清,确定人 PrP多克隆抗体效价为1∶4 096,能与人mPrP特异性结合.证明获得的人mPrP具有良好的免疫原性.     

非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体，根据HLJ/2018株的I177L序列，设计引物，扩增带有His标签序列的I177L序列，并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中，转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达和切胶纯化后，用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。结果显示，在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下，诱导5 h后，重组MBP-I177L蛋白表达量最高，蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符；重组蛋白以可溶性表达为主；多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示，抗体效价为1∶128 000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L,37℃诱导6 h,重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000;该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应,效价可达1∶1 000,特异性良好。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

口蹄疫病毒3B蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

为了深入研究口蹄疫病毒3B蛋白的结构及功能,本研究原核表达了3B蛋白并制备了针对3B蛋白的多克隆抗体。试验采用PCR方法扩增了口蹄疫病毒3B蛋白基因,并将其克隆到pET28a载体上,构建了重组质粒pET28a-3B,将其转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达。经过Ni-NTA琼脂糖亲和层析法初步纯化及Millipore超滤浓缩进一步纯化,将其免疫试验动物新西兰大白兔后制备出了抗3B蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测了该多抗的效价,Western blot试验检测了其反应性,通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验检测了该多抗的应用性。结果表明:该抗体的效价为1∶512000,反应性良好;IFA试验和Western blot试验中可以检测到过表达后定位于细胞核和细胞质中的3B蛋白,也可以检测到在真核细胞中过表达的3B蛋白。说明本研究制备的口蹄疫病毒3B蛋白多克隆抗体可以作为开展该病毒相关研究的重要材料。     

抗羊口疮病毒蛋白ORFV086多克隆抗体的制备及其应用

本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) pLys 感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100 ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1:128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。