H5N1禽流感病毒诱导哺乳动物呼吸道上皮细胞凋亡

近年来,高致病性禽流感病毒H5N1已引起了全世界范围内对全球流感大流行的高度关注,但对流感病毒H5N1的生物学发病机制的研究还存在很大空白。为了阐明禽流感病毒H5N1的发病机制,研究人员准备了12月龄猪肺泡组织上皮细胞,并测定了3株H5型禽流感病毒（A/Crow/Kyoto/53/2004[H5N1],A/Duck/Hong Kong/342/78[H5N2],A/Duck/Hong Kong/820/80[H5N3]）的生长动力学曲线,由此引起细胞病变,尽管所有3株病毒在鸡胚胎成纤维细胞可以引起类似细胞病变,但H5N1型病毒却可强烈诱导猪肺泡上皮细胞（pAEpC）的细胞凋亡。3株病毒在pAEpC内的增长和繁殖有相似之处。与此相反,只有在禽流感病毒H5N1感染的pAEpC细胞内才能检测到TUNEL阳性细胞,并且半光氨酸酶3、8和9的活性在禽流感病毒H5N1感染的pAEpC细胞内均显著升高,在禽流感病毒H5N2和H5N3感染的细胞内没有发现该现象。这些结果表明,只有H5N1型禽流感病毒诱导pAEpC的细胞凋亡。H5N1型禽流感病毒致病性在增加半光氨酸酶抑制剂Z-VAD-FMK后受到抑制;然而在病毒生长或释放子代病毒方面无显著差异。采用反向遗传学技术进一步研究结果表明,H5N1禽流感病毒HA蛋白在感染的pAEpC细胞中对半光氨酸酶依赖的细胞凋亡起着关键作用。H5N1病毒特异性的细胞病变在人类主要呼吸道上皮细胞中也可观察到。综上数据表明,禽流感病毒H5N1由于诱导细胞凋亡而导致哺乳动物呼吸道上皮细胞大量的细胞死亡。     

应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

为了验证荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的可行性,应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原评估检测方法的特异性,检测不同稀释度的H7N9亚型禽流感抗原,并用建立的方法检测采自三鸟批发市场100份泄殖腔、喉拭子。结果是建立的荧光RT-PCR方法,H7体系能检测出1:10-10抗原稀释度,N9体系能检测1:10-9抗原稀释度,对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应;检出100份泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。结果表明,荧光RT-PCR方法H7N9亚型禽流感病毒具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。     

中草药红茶菌体外抗甲I流感病毒(H_1N_1)作用研究

目的:从体外抗病毒试验观察中草药红茶菌制剂抗甲I型流感病毒(H1N1)作用。方法:利用细胞共培养法测定中草药红茶菌的细胞毒性;体外试验以H1N1感染MDCK细胞,观察用鸡红细胞凝集抑制法测试中草药红茶菌制剂体外对H1N1流感病毒的抑制效果。结果:中草药红茶菌制剂在1:2稀释度时对MDCK细胞存在66.25%的毒性作用,其在MDCK细胞上的半数毒性浓度TC50约为2-5倍稀释度;中草药红茶菌制剂在半数毒性浓度1:2和无毒浓度1:3稀释度时对流感病毒FM1株具有完全抑制作用,而在1:4稀释度下对病毒有50%的抑制作用,高于1:4稀释度的受试样品则不能抑制流感病毒FM1株的对鸡红细胞的凝集作用。     

应用适配体捕获建立H5N1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测技术

基于表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)和适配体捕获相结合技术，建立1种H5N1亚型禽流感病毒快速检测方法。本实验室筛选得到2条针对H5N1亚型禽流感病毒具有良好的特异性和灵敏度的适配体，与磁珠偶联建立针对H5N1亚型禽流感病毒捕获试剂，通过对捕获体系进行原位还原生成纳米银颗粒增强拉曼信号，建立了原位、快速、无损的H5N1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测技术。结果表明：H5N1亚型禽流感病毒在1 058 cm^-1处有特异性拉曼峰谱，该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。该方法的最低检测限达到原病毒液稀释的10¹⁰倍。利用本方法可在10 min内快速检测出待测样本中是否有H5N1亚型禽流感病毒的存在，能够在大体积、低浓度样品中快速检测出目标病原，满足H5N1亚型禽流感病毒临场快检的需求。     

戊二醛苯扎溴铵溶液对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果分析

采用悬浮杀灭试验,考察戊二醛苯扎溴铵溶液对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果。将戊二醛苯扎溴铵溶液通过不同稀释倍数(1 250、2 500、5 000、10 000、20 000)、在不同作用时间(5、10 min)观察其对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果。结果显示,戊二醛苯扎溴铵溶液在10000倍稀释,与H9N2亚型禽流感病毒作用5 min或10 min,灭活率达99.90%以上;在20 000倍稀释,作用5 min或10 min,灭活率均小于99.90%。表明戊二醛苯扎溴铵溶液在10 000倍稀释与H9N2亚型禽流感病毒(20±1)℃水浴作用5 min,即可对H9N2亚型禽流感病毒达到很好的灭活效果。     

某地区养殖户家禽禽流感的实验室诊断

为了防止禽流感的大规模暴发,减轻对人类健康的影响,本试验采用荧光免疫层析法对某地区养殖户的100羽患病鸡进行诊断。结果显示,通过H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测,该地区的100羽疑似患病鸡样本中,H5N1、H5N2亚型禽流感抗原检出阳性,而H9N2亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原结果为阴性;能检出H5N1、H5N2亚型禽流感病毒抗原100倍的稀释度;10次检测H5N1亚型禽流感抗原的变异系数为0.95%(P<0.05),差异不显著。此次诊断表明,该地区存在H5N1和H5N2型禽流感,不存在其他血清型的禽流感。     

格利特对模拟鸡舍环境中禽流感病毒的杀灭效果

为验证在有机物存在下格利特消毒剂杀灭禽流感病毒的能力,试验模拟鸡舍和周围环境的消毒实际情况,在鸡粪中混入H9亚型禽流感病毒,研究格利特消毒剂(20%戊二醛溶液)杀灭禽流感病毒的效果,结果:1∶100、1∶200和1∶400稀释的格利特消毒剂在4℃或25℃下作用20 min,均能100%杀灭混入鸡粪中的H9N2禽流感病毒;1∶200稀释的格利特消毒剂25℃下作用20 min,能杀灭存在于鸡粪和清洁剂中的100%H9N2禽流感病毒。1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600稀释的格利特消毒剂25℃下作用20 min,均能100%杀灭无鸡粪保护的H9N2禽流感病毒。结论:格利特消毒剂能杀灭有鸡粪保护的禽流感病毒。     

一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定

2004年从广东某地送检的病死天鹅肺组织中分离到1株禽流感病毒,用血凝抑制试验(HI)、聚合酶链反应(PCR)、基因测序等对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且H5亚型禽流感病毒标准阳性血清能对其产生特异性抑制作用;分别用针对禽流感病毒M基因、H5亚型禽流感病毒HA基因、N1亚型禽流感病毒NA基因特异性引物对该分离株进行PCR扩增,均获得特异性目的片段;测序及BLAST分析表明HA基因与A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003(H5N1)的HA基因同源性为98%;NA基因与A/swine/Fujian/1/2003(H5N1)的NA基因同源性为98%,由此该分离株鉴定为H5N1亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Swan/Guangdong/197/2004。     

亚洲国家应密切监控H5N1禽流感疫情传播

联合国粮农组织29日指出,H5N1这种可以通过家禽传染给人类的高致病型禽流感病毒在最近几年有不断扩散的趋势。粮农组织首席兽医官员卢布罗夫指出,近几年H5N1禽流感病毒传播有扩散的趋势,而且在中国和越南还出现了H5N1变种病毒,能使现有疫苗失去     

莪术油复方口服液对禽流感病毒H5N1亚型的抑制作用和攻毒保护试验

利用从中药莪术中提炼的莪术油制成的莪术油复方口服液,与鸡源禽流感病毒(AIV)H5N1在10日龄非免疫鸡胚中相互作用,观察莪术油复方口服液对禽流感病毒H5N1的抑制效果;用莪术油复方口服液对14日龄非免疫试验鸡连续口服喂药1周,采用禽流感病毒H5N1攻击鸡群,观察药物对鸡的保护效果。结果表明,在体外抑制试验中,0.25%、0.5%和1%的莪术油复方口服液对鸡胚为无毒浓度,对鸡胚的保护作用分别为60%、80%和80%;0.75%、1.5%和3%的莪术油复方口服液对试验鸡的保护作用分别为80%、100%和100%。病理组织检查结果表明鸡的肺脏无病变,并且增强了脾脏的免疫功能。初步结果显示,莪术油复方口服液对禽流感病毒具有显著的抑制作用。     

高致病性H7N9流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

2017年2月广东CDC首次报告了一种新的H7N9流感病毒变异株,该变异株在血凝素(HA)基因的裂解位点发生了插入型突变,从而成为对禽高致病性的H7N9流感病毒(HPH7N9)。因此,急需建立一种快速简便的H7N9流感病毒检测方法。根据HP-H7N9的HA基因序列,设计一组HP-H7N9特异性的RT-LAMP引物,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的RT-LAMP检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验。结果显示,本方法只对HPH7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到2.97×10~5copies(10-6稀释度)的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法操作简便,对设备需求较低,试验耗时短,反应结果可直接肉眼观察判读,适用于基层兽医站所、养殖场及野外监测点的HP-H7N9的快速筛查和监测。     

应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒

为了验证荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒的可行性,采用荧光免疫层析法分别对标准抗原和临床样品进行检测,评价该方法的特异性、敏感性、稳定性和方法的适用性。结果为H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出H7N9、H7N2亚型禽流感抗原阳性,对其他抗原检测结果为阴性;能检出H7N9、H7N2亚型禽流感病毒抗原(血凝效价1:512)1 000倍的稀释度;检测10次H7N9亚型禽流感抗原的变异系数为1.12%,差异不显著;检测临床100份样品结果均为阴性。结果表明,应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒操作简便、试验时间短、不受人为因素干扰,适合市场、养殖场大规模的监测或检疫。     

4种浒苔多糖的体外抗禽流感病毒活性研究

为了检测不同提取方法获得的浒苔提取物浒苔多糖1、浒苔多糖2、浒苔多糖3和浒苔多糖硒的体外抗禽流感病毒活性,试验将4种浒苔多糖用细胞维持液倍比稀释,以金刚烷胺、病毒灵、黄芪多糖和紫锥菊提取物为对照,以犬肾细胞(MDCK)为细胞模型,观察细胞病变效应(CPE),并采用MTT法研究4种浒苔多糖对H9N2禽流感病毒的直接杀灭、抑制病毒复制和阻断病毒吸附的治疗指数。结果表明:浒苔多糖1和浒苔多糖2直接杀灭H9N2禽流感病毒作用治疗指数分别为7.33和7.29,该指数低于金刚烷胺(33.56)、病毒灵(36.00)和黄芪多糖(15.78),高于紫锥菊提取物(6.92);浒苔多糖1和浒苔多糖2抑制H9N2禽流感病毒复制作用的治疗指数分别为5.78和6.13,该指数低于金刚烷胺(22.68)、病毒灵(26.71)和黄芪多糖(10.18),高于紫锥菊提取物(5.41);浒苔多糖1和浒苔多糖2阻断H9N2禽流感病毒吸附作用的治疗指数分别为13.83和12.75,该指数低于金刚烷胺(46.61)、病毒灵(55.20)和黄芪多糖(16.25),高于紫锥菊提取物(11.22);浒苔多糖3和浒苔多糖硒不具有直接杀灭病毒、抑制病毒复制和阻断病毒吸附的作用。说明浒苔多糖1和浒苔多糖2具有体外抗禽流感病毒活性,表现为对H9N2禽流感病毒具有直接杀灭、抑制病毒复制和阻断吸附的作用,浒苔多糖3和浒苔多糖硒无体外抗禽流感病毒活性。     

H5N1禽流感病毒核酸多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒的基质蛋白(M)基因序列和H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因设计并合成了三对特异性引物,用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鉴定方法。试验证明,建立的多重PCR方法可以将H5N1与H6N2、H9N2有效区分。该方法具有较好的灵敏度和特异性,适合在基层动物防疫和监督部门进行H5N1禽流感病毒核酸的检测。     

通过电穿孔法用血凝素蛋白DNA疫苗对小鼠进行单独免疫可以诱导其产生针对H5N1亚型禽流感病毒的早期保护

试验背景：研制一种疫苗使人类免受H5N1亚型禽流感病毒的感染是一项迫在眉睫的任务。DNA疫苗是传统疫苗的替代品,可以预防新的H5N1亚型禽流感病毒的出现。在本试验中,笔者对用表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白（HA）的质粒DNA进行单独免疫时在感染早期是否可以使小鼠模型抵抗致死攻击进行了评估。试验方法：在对小鼠进行致死攻毒前的第3、5、7天用HA疫苗分别单独免疫1次。小鼠的存活率、肺中病毒的滴度及体重的变化作为评估疫苗保护力的指标。在免疫后的不同天数,摘除小鼠眼球收集血清并通过ELISA和HI试验对特异性抗体进行检测,用以测定HA DNA疫苗介导的体液免疫反应。免疫后分离脾细胞,通过ELISPOT试验测定抗原特异性T细胞反应。试验结果：攻毒试验结果表明,用H5N1亚型禽流感病毒HA DNA疫苗进行单独免疫可以产生针对同型致死病毒量的有效的早期保护。免疫学分析显示,在免疫后的短时间内小鼠体内可以产生具有抗原特异性的抗体及T细胞反应。疫苗的保护能力取决于所注射的DNA的量及免疫后的持续时间。结论：与电穿孔法相结合,用100μg H5N1亚型禽流感病毒HA DNA疫苗对小鼠进行单独免疫能够在同型病毒感染的早期产生保护力。     

清毒片体外抗H1N1亚型流感病毒的研究

以MDCK细胞为H1N1亚型流感病毒宿主,金刚烷胺为阳性对照药物,通过细胞病变效应(CPE)和噻唑蓝比色法(MTT)测定清毒片对病毒的3种不同作用方式,即先感染病毒后给药,先给药后感染病毒和药物病毒同时作用,每种方式3个重复,观察清毒片对H1N1亚型流感病毒的抑制作用。结果表明,中药清毒片具有不同形式的抗H1N1亚型流感病毒作用,抑制病毒在细胞内合成作用,阻止病毒吸附传入细胞作用和直接灭活病毒作用。清毒片抑制H1N1亚型流感病毒在细胞内合成作用的3个重复的半数有效浓度(EC50)分别为411、434、532μg/mL,治疗指数(TI)为3.5;清毒片阻止H1N1亚型流感病毒的吸附、传入细胞的3个重复的EC50分别为404、458、467μg/mL,TI为3.6;清毒片对H1N1亚型流感病毒直接灭活作用的3个重复的EC50分别为479、481、461μg/mL,TI为3.4。说明清毒片体外对H1N1亚型流感病毒株具有明显的抑制作用,为H1N1亚型流感病毒感染的治疗和临床用药提供了理论依据。     

人流感病毒和禽流感病毒感染不同的靶细胞

自1997年以来,发现H5 N1、H9N2、H7N7亚型的禽流感病毒都能感染人。通常认为禽流感病毒在人体内复制受细胞受体和呼吸道细胞外抑制物的限制,但其确切机制却还不清楚。最近,科学家通过体外培养不同的人呼吸道上皮细胞,发现人流感病毒和禽流感病毒分别感染不同的靶细胞。在单周期感染(single- cycle infection)过程中,人流感病毒主要感染无纤毛细胞(non-ciliated cells) ,而禽流感病毒和在鸡胚适应的具有禽流感病毒样受体特异性的人流感病毒主要感染有纤毛的细胞,这与无纤毛细胞上主要有人流感病毒受体(2 - 6位交联的唾液酸) ,有纤毛细胞上…     

镁叶绿酸钠体外抗猪流感病毒的作用效果研究

为探讨蚕沙提取物中镁叶绿酸钠体外对猪流感病毒(H3N2)的抑制作用,通过低血清培养非洲绿猴肾细胞(Vero),在添加胰酶的条件下进行体外病毒感染,病毒与药物通过3种不同给药方式(感染病毒后添加药物、添加药物后感染病毒、病毒与药物直接感作)作用于细胞导致细胞病变(CPE),通过微量细胞培养试验观察细胞病变效应,从而观察镁叶绿酸钠对猪流感病毒的抑制及对被感染细胞的保护作用,并通过Reed-muench法计算药物作用前后TCID5(0半数细胞感染量)的变化,评价药物抗病毒效果。结果显示,镁叶绿酸钠药物最大安全浓度为33μg/mL,治疗作用的最小浓度为0.516μg/mL,预防作用的效果不突出,病毒对药物的直接阻断作用的最小浓度为0.258μg/mL。     

H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒.     

不同浓度格利特消毒剂对鸡粪中H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果观察

为验证在有机物存在下格利特(20％戊二醛溶液)消毒剂杀灭禽流感病毒的能力,试验模拟空栏鸡舍和周围环境消毒实际情况,在鸡粪中混入H9亚型禽流感病毒,以接种鸡胚尿囊液中H9亚型禽流感病毒血凝价＜2 log2判为感染阴性,以样品经消毒剂作用后检测不到病毒含量(即0EID50)为病毒完全杀灭(100％杀灭病毒),研究格利特消毒剂杀灭禽流感病毒的效果,结果显示:1∶400以下稀释的格利特消毒剂4℃或25℃作用20 min,均能100％杀灭混入鸡粪中的H9N2禽流感病毒;1∶200稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,能100％杀灭存在于鸡粪和清洁剂中的H9N2禽流感病毒.1∶1600以下稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,均能100％杀灭无鸡粪保护的H9N2禽流感病毒.