感染PRRSV弱毒株后仔猪病毒血症和抗体产生规律

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R弱毒株在仔猪体内的增殖及其诱导抗体产生的规律。本试验将PRRSV CH-1R弱毒株肌肉注射免疫9头45日龄健康仔猪,于免疫后0,7,14,28,35和42 d通过前腔静脉采取新鲜血液,利用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV在猪体内的增殖,ELISA方法检测抗PRRSV抗体,并利用基于PAM细胞建立的中和试验检测中和抗体。结果显示:PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后7 d病毒在100%仔猪体内开始复制,免疫后7～14 d时100%仔猪出现病毒血症,且病毒拷贝数达到最高,28～35 d时56%仔猪病毒血症消失,42 d时67%仔猪病毒血症消失;ELISA检测发现免疫后7～14 d仔猪均未产生抗PRRSV抗体,28 d时44%仔猪开始产生抗PRRSV抗体,42 d时78%仔猪抗PRRSV抗体水平达到最高,有2头猪在0～42 d一直未检测到抗PRRSV抗体;利用基于PAM细胞上建立的检测中和抗体的方法检测,免疫后7～14 d均未产生中和抗体,28 d时仅有22%仔猪产生低水平的中和抗体,35 d时78%仔猪产生中和抗体,且在42 d时其中和抗体水平达到最高。结果表明,PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后病毒血症在7～14 d达到高峰,免疫接种后28～42 d大部分仔猪病毒血症逐渐消失,即病毒增殖随时间呈递减趋势;抗PRRSV抗体及中和抗体均在免疫接种后28 d开始出现且在42 d抗体水平达到顶峰,即抗体水平随时间呈递增趋势。抗PRRSV的ELISA抗体与中和抗体水平呈正相关,而抗PRRSV中和抗体水平与病毒增殖呈负相关,但是有33%仔猪体内一直存在病毒,表明PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后,可诱导较低水平的抗体免疫保护反应,同时也可引起较低水平的病毒血症。     

中和抗体在抗猪繁殖与呼吸综合征感染过程中的作用

中和抗体在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染过程中起重要作用,被动输入PRRSV的中和抗体可预防PRRSV感染妊娠母猪,并且对母猪和仔猪都可起到消除性免疫作用。然而在自然感染PRRSV的过程中,这种中和抗体产生较晚,为病毒在宿主体内大量复制并感染其他易感动物提供了充裕的时间。PRRSV的主要中和位点位于糖蛋白GP5,核心区域称作B位点,GP5的另一个显性表位称作A位点,是非中和位点。A位点与B位点的同时出现将会抑制机体对B位点的免疫反应。当PRRSV发生中和位点突变时,产生无位点A的PRRSV,这种类型的PRRSV可诱导中和抗体的产生。文章通过对PRRSV的免疫反应、中和抗体的作用以及中和位点等三方面的阐述,综述了中和抗体在抗PRRSV感染过程中的作用。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究

为证实GP5蛋白B表位是否具有诱导抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的能力,本实验合成了PRRSV CH-la株和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HuN4株B表位的短肽,分别免疫家兔制备两份特异性多肽抗血清.此外,将12头PRRSV及其抗体均为阴性的健康仔猪以HP-PRRSV HuN4疫苗毒株(HuN4-F112)进行基础免疫,然后用强毒株(HuN4-F5)进行多次接种,制备猪高免血清.间接免疫荧光检测(IFA)结果显示,两份多肽抗血清均能与PRRSV经典株和变异株发生特异性反应,IFA抗体效价无差异,表明两份血清没有显著差异.病毒中和试验结果表明,两份多肽抗血清均不具有中和PRRSV活性.间接ELISA和病毒中和试验结果表明,猪高免血清中针对B表位肽的ELISA抗体水平与血清抗PRRSV中和抗体之间没有正相关关系,而且B表位肽不能抑制中和抗体.以上结果表明HP-PRRSV B表位不能诱导产生中和抗体.     

PRRSV VR2332弱毒株经滴鼻、注射途径接种仔猪的病毒血症和抗体产生的差异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血,于第43天采血后摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价,用基于PAM的中和试验检测抗PRRSV中和抗体效价。结果显示:仔猪感染PRRSV后,①滴鼻组第3天只在2头猪血清中检测到PRRSV,第15-19天病毒血症达到高峰,病毒拷贝数均大于104拷贝·μL-1,第27天后病毒血症消失;注射组第3天从3头仔猪血清中均检测到病毒,在第15-23天病毒血症达到高峰,其中第19天病毒拷贝数大于105拷贝·μL-1,病毒血症从第31天后开始消失。②从几种淋巴结和PAM中均检测到PRRSV,且注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组。③均在第27天从血清中检测到抗PRRSV抗体,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,且第35-43天,注射组的抗PRRSV抗体水平高于滴鼻组。④滴鼻组在第35天之前抗PRRSV中和抗体效价都小于1∶2,第43天抗PRRSV中和抗体效价为1∶2;注射组在第3、11和19天的抗PRRSV中和抗体效价均小于1∶2,第27、35、43天的中和抗体效价分别为1∶4、1∶8、1∶4。试验结果表明,注射组的病毒拷贝数一直为滴鼻组的10～100倍,且病毒血症持续时间更长;注射组血清中抗PRRSV抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体水平比滴鼻组高;滴鼻组抗PRRSV中和抗体水平很低,注射组产生的抗PRRSV中和抗体比滴鼻组早且抗体水平高。综上所述,VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能刺激猪产生更高水平的中和抗体,但同时也会引发更高水平的病毒血症。     

抗PRRSVGP5和M蛋白独特型抗体替代抗原诱导机体产生中和抗体的研究

制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗独特型抗体(Ab2),探讨Ab2替代抗原对机体免疫调节作用的研究。用纯化的PRRSV-GP5(GP5-Ab1)蛋白和抗PRRSV-M(M-Ab1)蛋白单抗免疫大白兔,当免疫血清琼扩效价达1:16以上,加强免疫后心脏采血分离血清,分别纯化兔抗PRRSV-GP5IgG(GP5-Ab2)和抗PRRSV-MIgG(M-Ab2)血清,分别用GP5-Ab2、M-Ab2以及GP5-Ab2与M-Ab2混合型三种分别免疫未免PRRS疫苗的小猪,同时设PRRS弱毒苗、灭活苗和空白组作对照,免疫后21d采集猪血清,间接ELISA检测免疫Ab2和PRRS疫苗的猪血清全为阳性,空白组仍然为阴性。经细胞中和试验证明免疫Ab2及PRRS疫苗的猪血清都具有中和抗体,说明Ab2在体内具有替代PRRSV的作用诱导机体产生具有中和效应的中和抗体,从而起到保护机体免受PRRSV的感染作用,为猪繁殖与呼吸综合征病新型疫苗的研究提供了新的思路。     

抗独特型抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫作用

用PRRSV感染SPF猪，血清检测结果显示，机体不仅产生抗PRRSV抗原的各种抗体(Ab1)，而且产生针对这些抗体的抗独特型抗体(Ab2)。根据各种蛋白质的等电点不同，应用IEF技术分离纯化出PRRSV感染猪血清中的不同IgG。分别以纯化的抗PRRSV—GP5蛋白、抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫SPF猪各5头，7d后经鼻腔感染PRRSV，定期采集血样进行病毒分离或鉴定试验。抗PRRSV-GP5蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；3头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；2头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；2头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；3头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—GP5和抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫作用显著，可作为PRRSV-GP5和PRRSV—M蛋白的替代抗原产生具有中和效应的抗体，保护机体免受PRRSV的感染。     

特异性中和抗体终止猪体内猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（VR-2332）的ORF6及ORF7部分保守序列，设计合成1对特异引物，通过优化RT—PCR反应条件，建立了从血清中检测PRRSV RNA的RT—PCR诊断方法。60日龄仔猪经鼻腔接种1mL 10^5.6TCID50/／mL PRRSV强毒液，7d后肌肉注射中和效价为1：64的特异性高免血清，每隔1周利用RT—PCR检测猪体内PRRSVRNA，5周内PRRSV RNA检测均为阴性，表明高滴度特异性中和抗体完全终止了PRRSV感染猪体内的病毒复制。     

高致病性PRRS活疫苗(HuN4-F112株)抗体对Ⅱ型不同亚群PRRSV的中和效果

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)活疫苗(HuN4-F112株)诱导的抗体对II型不同亚群PRRSV的中和作用,本研究将10头PRRSV抗原、抗体阴性的6周龄仔猪,每头仔猪肌肉注射1头份疫苗(106.0TCID50/mL),每周采血并分离血清,检测该血清对II型PRRSV第1、2、4亚群的代表病毒株勃林格PRRSV活疫苗(VR-2332株)、PRRSV活疫苗(CH-1R株)和HP-PRRSV活疫苗(HuN4-F112株)的中和效价。实验结果显示,仔猪免疫3周后开始产生针对HuN4-F112的中和抗体,11周至22周抗体水平达到高峰,抗体持续至少25周,但只有少数免疫猪在几个时间点的血清对VR-2332和CH-1R疫苗株具有血清交叉中和作用,而且中和效价较低。     

不同特性IgG促进PRRSV在PAM细胞中的增值作用

本试验通过研究IgG对猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)增殖情况的影响,来探讨抗PRRSV特异性和PRRS非特异性抗体在PRRSV-ADE中的作用。分别将抗PRRS特异性IgG(2.64g/L)和非特异性IgG(2.63g/L)作倍比稀释,与等体积含200TCID50/100μL的PRRSV Hn-1/06株病毒液混合,制备成一系列的感染性免疫复合物(PRRSVIgG)和阴性抗体-病毒混合液(PRRSV+IgG),接种PAM细胞;同时将纯化的猪阴性IgG(2.63g/L)和兔抗猪IgG(2.64g/L l)等体积混合制备免疫复合物(IC),分别与等体积含200TCID50/100μL的PRRSV Hn-1/06株病毒液混合,制备成免疫复合物-病毒混合液(PRRSV+IC),接种PAM细胞。接种24h后,用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV的mRNA水平。同样的方法,分别将2倍稀释的PRRSV-IgG,PRRSV+IgG和4倍稀释的PRRSV+IC接种PAM细胞,用实时荧光定量PCR方法分别检测感染12、24、36和48h后不同时间段内PRRSV的mRNA水平。结果显示,一定质量浓度的PRRS特异性亚中和水平抗体和非特异性抗体,在感染48h内均能极显著促进PRRSV在PAM细胞中增殖;而适当剂量的免疫复合物,在感染48h内也均能促进PRRSV在PAM细胞中增殖。结果表明,一定质量浓度的PRRS特异性亚中和水平抗体和非特异性抗体均能促进PRRSV在PAM细胞中增殖,但是不同特性的抗体对PRRSV的增殖能力存在着差异。     

应用原位杂交技术研究母源抗体对PRRS病毒在体内增殖的影响

挑选母源抗体阳性及母源抗体阴性仔猪各2头,人工感染PRRSV,感染后不同时间采集扁桃体、胸腺、脑、肺脏、肩前淋巴结、脾脏、肝脏等组织做成多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片。应用针对PRRS病毒（PRRSV）基因ORF6片段的特异性探针进行原位杂交检测,结果表明,2头母源抗体阴性猪的组织中均可检出病毒阳性信号,而2头母源抗体阳性猪仅可在少数组织中检出病毒阳性信号。以上结果表明,母源抗体会影响同种病毒在体内的增殖。