用不同家蚕品种5龄幼虫培育蚕蛹虫草中的1-脱氧野尻霉素含量检测

家蚕幼虫体内的活性物质1-脱氧野尻霉素(DNJ)的含量在家蚕品种之间存在差异。以蛹虫草菌(Cordyceps militaris)感染家蚕幼虫生产蚕蛹虫草,分别以20个家蚕品种的5龄第3天幼虫作为寄主,调查96 h家蚕感染率、10 d出草率及蚕蛹虫草中的DNJ含量,筛选蚕蛹虫草产量高且富含DNJ的家蚕品种。结果表明,蛹虫草菌对不同家蚕品种幼虫的感染率无显著差异,感染率和10 d出草率均达到100%;不同家蚕品种5龄第3天幼虫制备全蚕粉样品中的DNJ含量存在极显著差异,其中家蚕品种楚玉样品中的DNJ质量分数最高达0.557 5%,用不同家蚕品种5龄第3天幼虫培育的蚕蛹虫草中的DNJ含量也存在极显著差异,其中用家蚕品种东四单幼虫培育蚕蛹虫草样品中的DNJ质量分数最高达0.239 7%。依据试验结果初步认为,不同家蚕品种幼虫接种同一株蛹虫草菌对人工培育蚕蛹虫草的出草率没有影响;蛹虫草菌在蚕体内生长过程中会在一定程度降低蚕体原有的DNJ含量,家蚕品种东四单的5龄幼虫可用于生产高DNJ含量的蚕蛹虫草。     

不同家蚕品种对桑叶中1-脱氧野尻霉素的富集能力调查

家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(DNJ)来源于桑叶,为筛选对食下桑叶中DNJ有较强富集能力的家蚕品种用于功能性食品及药物的开发,以18个家蚕品种和6个桑树品种为材料,采用反相高效液相色谱-紫外检测法测定供试家蚕品种5龄第3天幼虫制备全蚕粉中的DNJ含量。不同地理系统家蚕品种对食下桑叶中DNJ的富集能力存在明显差异,其中日系品种与欧系品种对桑叶中DNJ的富集能力有显著差异(前者DNJ质量分数平均为0.3007%,后者为0.2469%),中系品种的DNJ质量分数平均为0.288 0%,与日系品种与欧系品种之间无显著差异;不同眠性(三眠与四眠)家蚕品种间对桑叶中DNJ的富集能力差异不明显。18个供试家蚕品种中,中系品种797对桑叶中DNJ的富集作用最强,其全蚕粉中的DNJ质量分数达0.4345%。选择6个家蚕品种分别取食不同桑树品种的桑叶,分析全蚕粉中的DNJ含量和桑叶中DNJ含量的相关性,其相关系数为0.826 0,全蚕粉中DNJ含量最高的家蚕品种与桑品种组合为家蚕乌2与陕桑403,其次为家蚕武功土种与甜桑、家蚕798与陕桑403。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

不同发育阶段家蚕体内抗坏血酸含量的变化

抗坏血酸又称维生素C(Vc),是家蚕幼虫生长发育必需的营养物质。为探讨在非取食阶段家蚕体内还原型抗坏血酸(AsA)的来源,采用分光光度法测定家蚕在不同发育时期以及不同条件下体内的AsA含量和总抗坏血酸(TAA)含量变化,并采用实时荧光定量PCR检测AsA合成相关酶基因在家蚕不同发育阶段的表达量变化。滞育卵中AsA含量在产卵24 h内,TAA含量在产卵72 h内均有所增加,此后二者的含量均不同程度降低并一直保持相对稳定;即时浸酸解除滞育蚕卵的AsA含量在产卵24 h内显著增加,且在产卵48~144 h一直保持较高水平,到胚胎发育后期又明显下降,但AsA含量一直高于滞育卵。幼虫期取食桑叶或添加Vc的人工饲料之后,蚕体内AsA和TAA含量均增加,幼虫在眠中或取食缺乏Vc的人工饲料及饥饿一定时间后,体内的AsA和TAA含量均明显降低,尤其是饥饿后体内的AsA含量会下降到很低的水平。蛹期的TAA含量无显著变化,但雌蛹体内AsA含量在化蛹0~24 h显著升高,雄蛹体内AsA含量在化蛹0~144 h一直保持较高水平,到蛹后期才有较为明显的下降。编码AsA合成相关酶的4个同源基因BmG ULO_like1、BmG ULO_like2、BmA Lase_like1、BmA Lase_like2在中肠和脂肪体中的表达量总体上都是卵期及蛹期显著高于幼虫期,并且随卵和蛹的发育进程呈上升趋势。研究结果提示,家蚕胚胎发育期和蛹期的AsA来源途径,可能包括自身合成途径及由氧化型抗坏血酸(DHA)还原为AsA的途径,而在幼虫期主要从食物中吸收Vc,缺乏其他来源。     

蚕体黄酮类化合物的提取及不同家蚕品种间的含量差异

为了高效提取家蚕幼虫体内的黄酮类化合物及筛选富含黄酮类化合物的家蚕品种,通过正交试验优化提取工艺条件,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定分析16个黄血蚕品种和3个普通白血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量。家蚕幼虫粉经超声波预处理20 min后以80%乙醇溶解,当原料质量浓度为25 g/L,在60℃水浴中提取6 h的效果较佳,提取蚕体总黄酮的质量比达到0.473 mg/g。黄血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量极显著高于普通白血蚕品种,两类品种样品中的总黄酮平均质量比分别为0.560、0.513 mg/g。在16个黄血蚕品种中,以来源于东南亚地区的二化性品种幼虫体中的黄酮类化合物含量较高,是富含黄酮类化合物的家蚕品种资源。     

家蚕vasa基因的结构及表达型研究

vasa是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性。利用家蚕基因组和EST库的数据资源,分析了家蚕vasa基因的结构,并与已有报道的18个物种的VASA蛋白质的结构域序列进行了比对分析,同时对家蚕vasa基因在家蚕胚胎发育11个时期的表达型及幼虫期8个不同组织的表达特异性进行了验证。结果表明,家蚕vasa基因包含有13个外显子,比果蝇vasa基因的外显子数量(7个)增加了6个,在第3内含子有1个转座子插入;家蚕vasa基因在未受精卵和胚胎发育的各个时期均有表达,但只在幼虫生殖腺中有表达。将家蚕vasa基因的一条cDNA片段用地高辛标记作为探针,对家蚕幼虫的生殖腺及胚胎进行全胚原位杂交,结果进一步表明家蚕vasa基因在幼虫期只在精原细胞、精囊、卵巢管等生殖系相关的细胞和组织中表达,在发育5d胚胎的生殖腺部位也有明显表达。     

不同家蚕品种血淋巴总SOD活力的差异及与生命力和产茧量性状的相关性

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内的一种重要氧自由基清除剂,并在一定程度上影响到生物体的抗逆能力。通过调查分析家蚕5龄幼虫血淋巴总SOD活力在不同地理系统、不同化性品种间和不同温湿度饲养条件下的差异,探讨通过测定5龄幼虫血淋巴总SOD活力,选择家蚕抗性品种育种材料的可行性。结果表明:常温下中系二化性品种5龄幼虫血淋巴的总SOD活力显著高于日系二化性品种和多化性品种;32℃高温、RH 95%处理一定时间后中系二化性普通品种和耐高温高湿品系总SOD活力显著升高,日系二化性普通品种和耐高温高湿品系则显著下降,但所有供试品种在35℃高温、RH 95%处理一定时间后血淋巴总SOD活力都显著低于常温常湿组。对5龄幼虫血淋巴的总SOD活力与幼虫生命率和虫蛹率的相关性统计分析表明二者之间呈显著正相关,而与茧层率之间无显著相关性。研究结果提示,5龄幼虫血淋巴总SOD活力可作为家蚕抗性育种材料选择的生化指标之一。     

用不同蛹虫草菌株和家蚕品种幼虫覆土栽培蚕蛹虫草的试验

采用覆土培育的方法人工栽培蚕蛹虫草,在相同的培育环境条件下以6株蛹虫草菌(Cordyceps militaris)菌株和4个家蚕品种的5龄第6天幼虫供试,筛选合适的菌株和蚕品种。同一个家蚕品种的幼虫接种不同蛹虫草菌株的感染率差异显著;接种相同蛹虫草菌株120 h时,家蚕二元杂交组合与四元杂交组合幼虫间的感染率差异显著,至168 h,仅接种菌株H24的2个家蚕二元杂交组合间幼虫的感染率差异显著,各家蚕品种幼虫接种其余菌株的感染率已无显著差异,家蚕品种7532×湘晖的幼虫接种菌株LP4的感染率最高达到93.33%,并且该菌株对4个家蚕品种幼虫的感染能力显著高于其他菌株。不同菌株接种各家蚕品种幼虫的发菌率无显著差异。各家蚕品种幼虫接种菌株H24和H7未获得子实体,接种菌株H10和LP4的出草率最高,平均值分别为84.73%和88.70%。供试菌株和家蚕品种均显著影响蚕蛹虫草中3种活性成分的含量,并且菌株的影响更显著:以菌株L2接种7532×湘晖的幼虫培育蚕蛹虫草中的虫草素含量最高;以菌株H0接种932·芙蓉×7532·湘晖的幼虫培育蚕蛹虫草中的腺苷含量最高;以菌株H0接种洞·庭×碧·波的幼虫培育蚕蛹虫草中的虫草多糖含量最高。综合各项试验成绩初步认为:蛹虫草菌L2菌株和LP4菌株具有较高的生产应用价值;家蚕品种直接影响菌株的感染速度,对培育蚕蛹虫草中活性成分的含量也有一定影响。     

家蚕烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(BmNADK)的高温应激表达分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD kinase,NADK)是生物体内氧化还原调节和氧化应激反应的重要酶类。以对高温耐受性不同的家蚕品种的5龄幼虫为材料,进行34℃连续高温处理和42℃高温冲击3 h处理,通过实时荧光定量PCR检测家蚕NADK基因(Bm NADK)在雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个器官组织中的表达水平,探究该基因是否与家蚕对高温的应激反应有关。结果显示,5龄期2种高温环境胁迫均可引起Bm NADK基因在蚕体3个器官组织中上调表达,其中在脂肪体表达的上调最为显著,且雄蚕脂肪体中的上调表达明显高于雌蚕,当恢复常温环境条件时,Bm NADK基因在蚕体组织的表达量也随之下降;高温胁迫下Bm NADK基因在耐高温家蚕品种7532幼虫组织中的表达量高于对高温耐受性差的品种皓月。研究结果显示Bm NADK基因与家蚕对高温的应激反应相关,在耐高温家蚕品种及雄蚕体内的应激表达水平相对较高。     

白僵蚕化学成分含量分析

白僵蚕中的蛋白质、脂肪酸、草酸铵等都是重要的药理活性成分。本文对以中系二化、日系二化、多化和四元杂交种四个品系的8个家蚕品种繁殖的白僵蚕进行了主要化学成分的含量测定,并对实验结果进行了统计学分析。结果表明:不同品系家蚕品种繁殖的白僵蚕在各化学成分含量上存在显著差异,同一品系不同品种家蚕繁殖的白僵蚕化学成分含量亦有明显差别。不同蚕品种繁殖僵蚕间的成分差异可为特定药理成分为指标的白僵蚕的高效生产提供理论依据。     

小蚕期个体形体特征的研究

鉴别家蚕品种的真实性及检验蚕种杂交率是蚕桑生产的重要工作,但目前生产上还没有一种理想实用的方法。研究发现,采用体视显微镜(解剖镜)放大观察蚁蚕或1、2龄小蚕,不同蚕品种具有不同的蚕体颜色、斑纹、斑纹颜色和形状、体型等形体特征,这种形体特征与4、5龄大蚕的形体特征不同,据此可研究建立根据小蚕期形体特征鉴别家蚕品种及检验蚕种杂交率的方法。     

原蚕稚蚕颗粒人工饲料育的研究

调查了6个家蚕原种、2个杂交种对颗粒人工饲料的摄食性,重点探讨了4个原种1~2龄颗粒饲料育对其生长发育、产卵性能和叶卵转效率的影响。结果表明,不同蚕品种对颗粒人工饲料的摄食性存在极大差异,从24 h疏毛率来看,杂交种高于原种,日系品种高于中系品种。原蚕稚蚕颗粒人工饲料育的1~3龄发育经过比全龄桑叶育对照显著延长,但5龄期发育加快,差距缩小。小蚕颗粒人工饲料育对原蚕虫蛹生命率无明显影响,全茧量高于全龄桑叶育,但茧层率低于对照组。造卵数1~2龄颗粒饲料育略少于全龄桑叶育,但残留卵率显著降低,平均产卵量与全龄桑叶育基本相同,良卵率也无明显差异。小蚕颗粒饲料育的5龄食下量均低于全龄桑叶育,4个品种平均减少11.0%,叶卵转化率比全龄桑叶育平均提高15.6%。     

不同全蚕粉中的1-脱氧野尻霉素含量及其对小鼠血糖浓度的影响

为探讨全蚕粉中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin,1-DNJ)含量与降血糖效果的关系以及蚕体内1-DNJ的来源,测定了7个家蚕品种或杂交组合以及用5个桑品种和不同叶质桑叶饲养5龄蚕制备的全蚕粉中1-DNJ含量,同时测定了由相应的全蚕粉配制的蚕粉复合物对小鼠食后1.5 h血糖值的影响。结果表明,不同家蚕品种以及用不同桑品种和不同叶质桑叶饲养家蚕制备的全蚕粉复合物的降血糖效果均存在显著差异,凡是降血糖效果显著的全蚕粉,1-DNJ含量都处于较高水平,而1-DNJ含量低的全蚕粉其降血糖效果均较差,但降血糖活性与1-DNJ含量之间并不存在显著正相关关系,说明全蚕粉中还存在其它降血糖活性成分。养蚕用桑中的1-DNJ含量与蚕体内1-DNJ含量存在高度正相关性,而且用不含桑叶粉的人工饲料饲养的家蚕幼虫不含1-DNJ,因此证实了蚕体内的1-DNJ来源于桑叶,家蚕本身不能产生1-DNJ。     

Pb2+、Cd2+混合添食对家蚕生长发育及细胞凋亡的影响

家蚕自3龄起添食单一和混合的Cd2+、Pb2+重金属溶液,观察并记录其生长发育状况,测量各时期体长,提取DNA并分析断裂情况。结果表明,添食Pb2+、Cd2+两种混合重金属离子的家蚕体型比单一添食相应含量Cd2+的大,其体长大于单一添食相同含量Pb2+、Cd2+的家蚕;单一重金属离子作用下的家蚕DNA发生明显的梯状断裂,出现细胞凋亡现象,而混合重金属诱导的家蚕细胞DNA完整,未发生凋亡现象,预示着竞争位点假说在家蚕体内的存在。     

家蚕精子介导转基因技术体系的优化

为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。     

柞蚕酯酶同工酶的研究

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,调查了柞蚕酯酶同工酶在幼虫不同发育时期、不同组织器官及不同品种间的特异性变化:柞蚕酯酶同工酶活性和酶带数在幼虫不同发育时期存在一定的差异性,各龄盛食期酶带数目多且活性强,其表达与幼虫的生长发育有关;幼虫不同组织器官中酯酶同工酶的活性及种类差异很大,在脂肪体及中肠组织中活性较强,并且种类较多,酶活性的高低与组织的功能关系密切;酯酶同工酶在柞蚕品种间表现出很强的特异性,但在迁移率0.65处各品种均有1条共有谱带。UPGMA法聚类分析显示:33个柞蚕品种可分为4个大的类群,各品种与其母系亲本更多地表现出较近的亲缘关系,说明母系亲本在柞蚕杂交分离育种中起着决定性作用,所以杂交育种应优先注重对母系亲本性状的选择;部分品种在系统分离育种过程中来自亲本的一些性状逐渐弱化,而某一特定性状得到加强,与其亲本间表现出较远的亲缘关系。     

家蚕染色体工程及其应用研究——Ⅲ.家蚕雄核发育的诱导

采用适当剂量的丫-射线辐照羽化前2—3日的雌蛹,羽化后与未辐照雄蛾(具有隐性标志基因)进行单杂交或多品种雄蛾混精杂交,产下卵经一定温度热处理,获得并饲养近两万头雄核发育蚕,并将部分雄核发育蚕继代成功。所有雄核发育蚕都为雄性,且只表现父本性状,不表现母本性状。因而推测可能是卵核经Y-射线照射后失活,而进入卵内的精子经一定高温刺激后互相融合发育的结果。调查了经辐射处理后的杂交后代在不同条件热处理以及不同蚕品种在同样条件热处理下的雄核发育情况,证明产下卵须经一定高温处理,两个入卵精子才能融合而发育。     

家蚕种质资源品种的人工饲料摄食性研究

采用山东省蚕业研究所现有低成本人工饲料饲养本所家蚕资源品种,研究其摄食性,结果杂交种优于日系与中系,在收蚁与1龄期间是日系明显优于中系,至3龄起蚕日系的存活率也是明显高于中系,而在2龄期间存活下来的中系家蚕对人工饲料的摄食性优于日系。     

不同蚕品种对山莴苣的适应性初探

探讨不同蚕品种用山莴苣Lactuca indica L.饲育的适应性差异,为选育适应性强的蚕品种提供参考。从收蚁开始用山莴苣饲育,调查24h疏毛率、90%个体死亡时间、1～3龄的发育经过和眠蚕体重。供试的20个蚕品种对山莴苣均具有良好的摄食性,疏毛率都在99%以上。但不同蚕品种的存活时间、发育经过和眠蚕体重存在很大差异,总体上杂交种的适应性优于原种。结论:不同蚕品种对山莴苣的适应性存在最著差异,90%个体死亡时间和眠蚕体重是衡量适应性的有效指标。通过用山莴苣累代饲养和系统选择,可以提高后代的适应性。     

家蚕幼虫体中黄酮类化合物的提取与测定

家蚕自古为滋补食疗珍品,丰富的有效活性成分使其具有独特的药理作用,为推进家蚕幼虫体的药用开发,用紫外分光光度法研究了家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量在不同品种间的变化规律。将家蚕幼虫干燥粉碎,选用80%乙醇为溶剂,原料体积质量按0.0333g/mL在60℃下抽提4h,重复抽提3次,可高效地提取家蚕幼虫体黄酮类化合物。以NaNO2、Al(NO3)3显色,用紫外分光光度计于510nm波长下比色,可精确、稳定地测定出家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量。结果表明,家蚕幼虫体富含黄酮类化合物,不同蚕品种其含量存在显著差异。