家蚕品种7532和大造在高温冲击下中肠抗氧化酶活性的变化

为了探讨家蚕抗高温冲击的生理机制,比较了高温(36℃)冲击对家蚕二化性品种7532和大造5龄幼虫死亡率和中肠抗氧化酶活性的影响。自5龄24h起,供试家蚕品种大造经高温冲击24h以后,幼虫的累计死亡率就显著升高;而7532经高温冲击48h以后,幼虫的累计死亡率才显著升高。高温冲击48～72h,7532的5龄幼虫中肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性较高,且随高温冲击时间延长显著增加,而大造5龄幼虫中肠组织中SOD的活性较低,且高温冲击时间延长后的变化不显著;7532的5龄幼虫中肠组织中的过氧化氢酶(CAT)活性在高温冲击48h后显著升高,而大造5龄幼虫中肠组织中的CAT活性在高温冲击24h后显著下降,直到72h后才显著升高,并且7532中肠组织中的CAT活性显著高于在大造中肠组织中的活性;2个品种5龄幼虫中肠组织中的谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性分别在高温冲击24h和48h时达到峰值,在高温冲击48～72h期间,7532中肠组织中的GST活性显著高于大造中肠组织中的活性。上述结果提示,家蚕品种7532抗高温冲击能力较家蚕品种大造强,与其中肠组织中的抗氧化酶活性升高有关。     

高温高湿胁迫下家蚕不同耐受性品种的中肠组织数字基因表达谱分析

家蚕属于变温动物,环境温度和湿度对其生长发育有很大影响。选择一对高温高湿耐受性差异显著的家蚕品种932和皓月作为试验材料,采用高通量测序的方法,鉴定2个品种5龄幼虫经高温高湿(35℃±0.5℃,RH 95%±2%)处理后中肠组织中转录水平呈现差异的基因,初步分析这些差异基因参与的相关代谢途径,为探究家蚕品种耐高温高湿的分子机制积累基础信息。在正常环境条件下饲养,2个品种的5龄幼虫中肠组织中有552个表达差异显著的基因,这些差异表达基因共分布于44个GO功能注释小类中,与对高温高湿耐受性较差的皓月相比,对高温高湿耐受性较强的932幼虫,其中肠中与神经突触、抗氧化活性、电子载体活性和受体活性相关的基因高表达。与正常环境条件下饲养相比,在高温高湿环境胁迫下饲养,932与皓月的5龄幼虫中肠中分别有303和276个差异表达基因。通过KEGG Pathway显著性富集分析发现,932的差异表达基因在氧化磷酸化、蛋白质消化与吸收、氨基酸代谢及谷胱甘肽代谢等途径显著富集;皓月的差异表达基因在胰腺分泌、蛋白质消化与吸收、细菌与病毒侵染、m TOR信号等途径显著富集。鉴定的中肠差异表达基因可能与高温高湿胁迫下家蚕体内的生理生化反应及代谢变化等有关。     

选育家蚕抗病品种的基因工程研究 Ⅱ 家蚕卵基因克隆株重组质粒DNA诱导家蚕的变异及其遗传

家蚕多化性抗病品种白皮淡蚕卵基因克隆于大肠杆菌获得 pSO_(1～13)个克隆株,将它们的重组质粒 DNA 注射于家蚕二化性品种东34的生殖腺内,获得血淋巴酯酶同工酶谱产生倾向于供体的变异。东34血淋巴酯酶同工酶 Est—O 缺失,而变异的个体具有 Est—4~(0.7)的等位基因。变异系的第2代出现分离,其比率为3:1。第4代与亲本回交,子代的酯酶同工酶谱均具有 Est—4~(0.7)型,因此属于显性因子。经连续5代的筛选,得到新的品系,定名东基1号。对高温多湿的环境有一定的抵抗力。     

家蚕品种对高温多湿抗性的调查试验

为探明不同家蚕品种对高温多湿抗性的差异,笔者对我单位保育的10个家蚕品种进行抗高温、多湿试验,结果显示:不同品种之间有显著差异,以乙9(932江苏保存品系,2000年从何斯美老师处引进)对高温多湿的抗性最好;杂交种的综合抗性与其对高温多湿抗性存在一定的正相关关系。探索建立家蚕品种对高温、多湿抗性鉴定平台。     

不同蜜蜂品种越冬后期血淋巴总SOD活力与抗寒力的相关性研究

为探讨通过测定蜜蜂血淋巴总SOD活力,做为选择抗逆蜜蜂育种指标的可行性。应用黄嘌呤氧化酶法测量不同品种蜜蜂越冬后期血淋巴总SOD活力,应用热敏电阻+数字电表法测量蜜蜂抗寒力。结果表明,卡尼鄂拉蜜蜂与意大利蜜蜂血淋巴总SOD活力差异显著,蜜蜂血淋巴总SOD活力与过冷却点具有显著相关性。研究结果提示,蜜蜂血淋巴总SOD活力可作为蜜蜂抗逆育种材料选择的生化指标之一。     

不同家蚕品种与野桑蚕大龄期幼虫血淋巴和体壁中的多酚氧化酶活性检测分析

多酚氧化酶(PPO)在昆虫的变态发育和免疫防御中有重要作用。选择菁松、黑缟和大造3个家蚕品种及来自桑园的野桑蚕作供试昆虫,以其担负免疫功能的血淋巴和作为免疫屏障的体壁组织为材料,测定与分析家蚕、野桑蚕幼虫大龄期及化蛹前血淋巴和体壁中的PPO活性变化。3个家蚕品种幼虫血淋巴中的PPO活性由高到低依次为菁松、黑缟、大造,体壁中的PPO活性由高到低依次为大造、黑缟、菁松。野桑蚕幼虫不论是血淋巴还是体壁,其PPO活性均低于家蚕,其中血淋巴的PPO活性显著低于家蚕。家蚕幼虫血淋巴的PPO活性在整个5龄期都较高,体壁的PPO活性则是在5龄中后期和上蔟期较高。野桑蚕幼虫血淋巴的PPO活性在5龄中期较高,体壁的PPO活性则是在5龄末期较高。另外发现2个供试家蚕品种幼虫血淋巴和体壁间的PPO活性变化呈完全相反的情况:菁松的幼虫是血淋巴中的PPO活性较高,体壁中的PPO活性较低;大造的幼虫是血淋巴中的PPO活性较低,而体壁中的PPO活性较高。上述结果提示:家蚕、野桑蚕幼虫的PPO活性变化具有明显的发育时期和组织特异性,且家蚕的PPO活性高于野桑蚕,家蚕品种间的PPO活性的组织差异性也不尽相同。这些结果为研究家蚕蜕皮变态过程中的体壁形成和先天免疫功能等提供了新的信息。     

蚕体黄酮类化合物的提取及不同家蚕品种间的含量差异

为了高效提取家蚕幼虫体内的黄酮类化合物及筛选富含黄酮类化合物的家蚕品种,通过正交试验优化提取工艺条件,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定分析16个黄血蚕品种和3个普通白血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量。家蚕幼虫粉经超声波预处理20 min后以80%乙醇溶解,当原料质量浓度为25 g/L,在60℃水浴中提取6 h的效果较佳,提取蚕体总黄酮的质量比达到0.473 mg/g。黄血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量极显著高于普通白血蚕品种,两类品种样品中的总黄酮平均质量比分别为0.560、0.513 mg/g。在16个黄血蚕品种中,以来源于东南亚地区的二化性品种幼虫体中的黄酮类化合物含量较高,是富含黄酮类化合物的家蚕品种资源。     

低温贮藏期柞蚕种茧蛹体抗氧化酶活性测定

为探索抗氧化酶活性水平及变化与种茧耐贮性之间的关系，以7个二化性品种和1个一化性品种柞蚕种茧为试材，比较分析雌、雄蛹在低温贮藏不同时间后血淋巴总SOD、POD、CAT抗氧化酶活性变化情况。结果表明：低温贮藏期间，3种抗氧化酶活性变化趋势在化性、品种、性别间较为相似，但活性水平均存在显著性差异，一化性品种总SOD、POD活性显著高于二化性品种，CAT活性显著低于二化性品种，各二化性品种之间同样具有显著性差异；相较于春季出库期，二化一放出库期各二化性柞蚕品种种茧蛹体血淋巴3种抗氧化酶活性均发生显著下降，其中，大9雌蛹总SOD、POD、CAT活性下降幅度最小，且始终处于较高水平，凤久和辽蚕527的雄蛹3种抗氧化酶活性较高，说明大9的雌蛹耐贮性最强，凤久和辽蚕527的雄蛹耐贮性最强。研究结果可为柞蚕种茧耐低温贮藏研究与二化一放品种选育提供理论依据。     

氟化物对不同抗性家蚕品种的GST和AChE酶活性影响及雌雄个体间的酶活性差异

为了探明家蚕的耐氟性机制以及耐氟性在不同性别蚕体间的差异,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,自5龄起蚕开始分雌雄喂食清水和200 mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶,检测幼虫中肠谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和头部乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化。添食氟化物后耐氟和敏感家蚕品种5龄幼虫中肠的GST活力随添氟时间的变化趋势与对照组比较一致,且与对照组相比酶活性均呈增高趋势;敏感品种734添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.486倍,耐氟品种T6添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.529倍。敏感品种734对照组5龄幼虫在试验第3天头部的AChE酶活性显著升高,但添氟组雄蚕在试验第2天AChE酶活性即显著升高,而雌蚕的AChE酶活性在整个5龄试验期均呈平缓下降趋势;耐氟品种T6添氟组5龄雌、雄幼虫的AChE活力与对照组差异不大,酶活力随添氟时间的变化趋势也与对照组较为一致,均在第3天出现最低值;2个品种添氟组AChE酶活性的性别差异与GST相反,即雄蚕的AChE平均活力大于雌蚕。推测氟化物处理后耐氟家蚕品种仍然能够保持AChE酶活性水平,从而呈现对氟化物的耐受性;2种类型解毒酶活力在雌雄家蚕间的差异可能暗示同一品种雄蚕的耐氟能力较多涉及靶标抗性,而雌蚕的耐氟能力较多依赖于代谢抗性。     

家蚕烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(BmNADK)的高温应激表达分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD kinase,NADK)是生物体内氧化还原调节和氧化应激反应的重要酶类。以对高温耐受性不同的家蚕品种的5龄幼虫为材料,进行34℃连续高温处理和42℃高温冲击3 h处理,通过实时荧光定量PCR检测家蚕NADK基因(Bm NADK)在雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个器官组织中的表达水平,探究该基因是否与家蚕对高温的应激反应有关。结果显示,5龄期2种高温环境胁迫均可引起Bm NADK基因在蚕体3个器官组织中上调表达,其中在脂肪体表达的上调最为显著,且雄蚕脂肪体中的上调表达明显高于雌蚕,当恢复常温环境条件时,Bm NADK基因在蚕体组织的表达量也随之下降;高温胁迫下Bm NADK基因在耐高温家蚕品种7532幼虫组织中的表达量高于对高温耐受性差的品种皓月。研究结果显示Bm NADK基因与家蚕对高温的应激反应相关,在耐高温家蚕品种及雄蚕体内的应激表达水平相对较高。     

家蚕氟化物中毒后血淋巴中脂质过氧化物和抗氧化物含量及抗氧化酶活性的变化

为了探究氟化物对家蚕的毒理作用,通过给家蚕5龄期幼虫添食NaF,检测氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中脂质过氧化物质丙二醛(MDA)、抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的含量变化以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等抗氧化物酶的活性变化。正常家蚕幼虫和氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中的MDA含量在5龄期均逐渐下降,但氟化物中毒家蚕的MDA平均浓度比正常家蚕升高了83.77%;GSH含量变化趋势为5龄第1天和第5天较高,第3天较低,但氟化物中毒家蚕5龄期的GSH浓度平均比正常家蚕下降了47.81%;氟化物中毒家蚕5龄期的GSH-Px和GST的平均活性分别比正常家蚕升高63.49%、39.22%,5龄第3天达到最高峰,5龄第1天和第5天较弱。初步分析认为家蚕幼虫血淋巴中MDA和GSH的含量变化以及GSH-Px和GST的活性变化,与家蚕氟化物中毒后体内氧自由基含量上升和脂质过氧化作用增强密切相关,可作为诊断家蚕氟化物中毒的生化指标。     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

氟中毒对桑蚕碱性磷酸酶活性及蚕体重的影响

本文通过添食NaF的方法，探讨了氟中毒对天体重及中肠组织ALKP酶活性的影响，蚕品种之间的耐氟性存在显著差异，氟中毒后蚕体重显著降低，NaF对中肠组织ALKP酶有明显的抑制作用，氟中毒后蚕体重变化与中肠组织ALKP酶活性的变化相关性密切，具有同步性，1％Ca^2 对氟化物抑制作用有一定的缓解作用。     

家蚕血液超氧化物歧化酶活力及其影响因素

家蚕血液超氧化物歧化酶（SOD）随着蚕的发育而呈现有规律的动态变化：幼虫4龄期SOD活性高于5龄，同一龄中以龄初和龄末较高，而中期较低；化蛹后．SOD活性迅速增加，蛹中期活性达到最大值，随后迅速下降直至羽化；雌蚕的SOD活性均高于雄蚕，但蛹期SOD活性却以雄性较高；不同蚕品种间SOD活力有较大差异；SOD活力与饲料也有很大关系，人工饲料有蚕的活力显著高于桑叶育蚕；氟化物处理在初期引起SOD活性上升，但随后即下降并低于对照。研究认为，家蚕体内SOD活性与蚕的发育、变态及健康状况具有密切的关系。     

造血器官受损对家蚕血球机能与抗菌活性的影响

为了研究家蚕造血器官受损后的血球机能与抗菌活性 ,对家蚕幼虫的造血器官进行碳离子射线局部照射 ,调查了照射后血球的生死比率及血液的抗菌活性。结果表明 :对照蚕整个 5龄期血液中的死血球数基本不变 ;而照射蚕血液中的死血球数及机能低下的血球数随着发育明显增加 ,熟蚕时与对照蚕达到极显著差异 ;照射蚕血清中的酚氧化酶活性及对大肠杆菌的杀灭效果明显比对照蚕低。由此认为 ,血球的数量减少及其机能低下是引起家蚕免疫机能下降的主要原因。     

家蚕超氧化物歧化酶(SOD)不同品种活性差异的研究

对西南农业大学家蚕基因库和育种室的114个家蚕品种及遗传系统进行了SOD活性调查，结果表明：SOD活性最高值达237.375U/ml，而最低值为38.372U/ml，平均值为140.08U/ml；品种间SOD活性差异较大，其品种及遗传系统的活性值分布图似正态分布，而一代杂交种的活性值居双亲活性值中间，并推测SOD活性受多基因支配，但也有主基因作用。中国二化性品种SOD活性值比日本二化性品种高20％左右。     

SO2对家蚕血淋巴中谷胱甘肽含量及相关酶活性的影响

通过分析在SO2胁迫下家蚕5龄幼虫血淋巴中谷胱甘肽(GSH)含量及相关酶活性的变化,探讨SO2对家蚕的毒理作用机制。当对家蚕5龄幼虫每天以40 mg/m3SO2熏气刺激6 h,蚕体血淋巴中的GSH含量显著降低,雄蚕GSH的平均含量为49.8μmol/L,雌蚕为41.0μmol/L,分别为对照的73.80%和55.76%,而谷胱甘肽硫-转移酶(GST)活性显著升高,雄蚕GST的平均活性为31.86 U/L,雌蚕为31.80 U/L,分别高于对照46.15%和27.30%。与此同时,γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性在蚕体中也有不同程度的升高,其中在雄蚕体内的变化极为显著;谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和谷胱甘肽合成酶系的活性在蚕体内均无显著变化。以上结果表明:SO2刺激可对家蚕血淋巴中的GSH含量及其相关酶的活性产生影响,且雌、雄蚕对SO2的敏感性不同;GSH含量的减少及其相关酶活性的上升,说明SO2对蚕体的毒害作用与其降低蚕体抗氧化物质水平、削弱抗氧化防御系统有关。     

氟中毒家蚕幼虫血淋巴中谷胱甘肽含量的变化

家蚕血淋巴中含有一定量的谷胱甘肽(GSH)，它随着蚕体的生长发育呈现一定规律的变化，5龄前期较高，中期下降，到后期又迅速升高。同时，在一定程度的氟化物中毒以后，GSH含量也呈同样的变化趋势，但其含量比正常蚕少。因此，家蚕血淋巴中GSH含量的变化，可以作为了解家蚕氟中毒的一种依据。