耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化

研究耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达。从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌BYG5-20中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因xynA,将其构建在大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148中得到重组质粒pGJ148-xynA。采用电转化法将重组质粒pGJ148-xynA转入枯草芽孢杆菌1A747中,得到重组菌B.GJ148-xynA,然后进行诱导表达以及培养基的优化。重组菌GJ148-xynA发酵上清液中木聚糖酶酶活可达93.32IU/ml。耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶基因xynA可以在枯草芽孢杆菌中实现异源表达,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶分泌表达系统的进一步优化奠定了基础。     

黄曲霉毒素分解酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达与应用

本试验旨在研究黄曲霉毒素分解酶(ADTZ)基因在枯草芽孢杆菌中的表达与应用。试验通过构建枯草芽孢杆菌ADTZ基因的整合表达载体,将ADTZ基因整合到野生型枯草芽孢杆菌(B.subtilis LN)中,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步检测ADTZ蛋白的表达情况。将重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌种接种到发霉玉米中进行发酵试验,检测发霉玉米样品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量的变化,验证ADTZ基因在枯草芽孢杆菌中的表达效果。结果表明,通过构建整合表达载体成功将ADTZ基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中,在SDS-PAGE上检测到重组枯草芽孢杆菌能够分泌表达特异性蛋白条带。经过重组菌发酵的发霉玉米AFB1的含量较未接种和接种野生型枯草芽孢杆菌发酵的发霉玉米AFB1的含量差异显著(P0.05)。由此可见,ADTZ基因可成功整合到野生型枯草芽孢杆菌中,并进行了胞外分泌表达,表达产物具有生物活性,能有效地降解AFB1。     

抑菌肽在枯草芽孢杆菌中的构建表达、抑菌特性及发酵条件优化

本研究从蚯蚓中克隆得到抑菌肽基因ew T1,将其构建在枯草芽孢杆菌表达载体p HT43中得到重组质粒p HT43-ew T1,并转化至枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷型菌株WB800N中,得到重组菌,然后进行诱导表达以及发酵条件优化。优化后的重组菌发酵上清液对猪粪大肠杆菌的抑菌效价为47,362U/m L。蚯蚓抑菌肽基因ew T1可以在枯草芽孢杆菌中实现异源表达,为枯草芽孢杆菌抑菌肽分泌表达系统的进一步优化奠定了基础。     

玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及其对母猪繁殖性能的影响

本试验旨在建立玉米赤霉烯酮(ZEN)降解酶基因ZEN-jjm在枯草芽孢杆菌中的表达体系,确定其产物的生物降解活性及对母猪繁殖性能的作用。克隆ZEN-jjm基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后连接至p HT01表达载体中,构建重组质粒;转化枯草芽孢杆菌,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析ZEN-jjm蛋白表达水平。高效液相色谱法(HPLC)检测表达的ZEN-jjm蛋白降解ZEN的活性。通过对母猪的繁殖性能的评价,确定ZEN降解酶降解ZEN对母猪繁殖性能的影响。双酶切和测序结果表明:ZEN-jjm成功插入p HT01中,SDSPAGE表明获得1株高效表达目的蛋白的重组枯草芽孢杆菌,其大小约为29 ku。HPLC结果表明表达的ZEN-jjm蛋白能有效地降解ZEN;表达的ZEN-jjm蛋白能显著缓解ZEN对繁殖母猪的毒害作用(P0.05)。综上:1)本研究成功构建了表达ZEN-jjm在枯草芽孢杆菌中的表达载体,并在枯草芽孢杆菌中得到了表达。2)表达的ZEN-jjm蛋白具有降解ZEN的生物活性。3)在饲粮中添加ZEN-jjm蛋白能显著降低ZEN对母猪能繁殖性能的危害。     

表达EDA-EmIMP1的重组枯草芽孢杆菌的制备及其免疫效果评价

枯草芽孢杆菌可以作为外源蛋白的表达系统,其作为重组蛋白的递呈载体具有很大优势,而纤维连接蛋白外域A(EDA)是一种能够提高目标蛋白抗原性的佐剂。为增强巨型艾美耳球虫的免疫相关蛋白1(IMP1)的抗原性,本研究从已构建的重组质粒中扩增EDA-EmIMP1和EmIMP1基因片段,并构建重组表达质粒pHT01-EDA-EmIMP1和pHT01-EmIMP1,将获得的重组质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞,制备的重组枯草芽孢杆菌鉴定正确后增殖培养。将实验鸡分为5组,分别是:EDA组(免疫pHT01-EDA-EmIMP1重组枯草芽孢杆菌)、EmIMP1组(免疫pHT01-EmIMP1重组枯草芽孢杆菌)、枯草芽孢杆菌组、空白组(PBS)和攻虫对照组。每组鸡口服相应菌液(0.3mL1010cfu/mL菌液/只)进行免疫,每隔2周免疫1次,共免疫3次,每次免疫2周后采血。三免2周后攻虫。采用ELISA方法检测各组鸡血清中EmIMP1的抗体滴度以及细胞因子IL-10和IL-4的含量;并对攻虫后各组鸡的增重、肠道病变计分以及卵囊排出量进行计算。结果显示:制备的重组枯草芽孢杆菌可以表达目的蛋白,蛋白大小为70ku。ELISA检测结果显示,EDA组的抗体效价最高,约为1∶3200;三免EDA组的IL-10和IL-4的含量均显著高于其它组(p<0.05);EDA组的卵囊排出量显著低于其它组,而枯草芽孢杆菌组和EmIMP1组的卵囊排出量也均显著低于攻虫组(p<0.05);EDA组对肠道保护效果显著优于其它经过攻虫处理的组(p<0.05),而枯草芽孢杆菌组和EmIMP1组之间无显著差异;EDA组增重显著高于攻虫组和枯草芽孢杆菌组(p<0.05)。本研究证实枯草芽孢杆菌作为EmIMP1的抗原递呈载体可以有效提高免疫原性,其中EDA佐剂组的免疫效果最好。     

原位整合型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建

为证明原位整合能否用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示外源蛋白,本研究将芽孢衣壳蛋白CotB、CotZ的编码序列(不含终止密码子),与绿色荧光蛋白基因重组,构建含有融合片段cotB-gfp和cotZ-gfp的原位整合型表面展示载体pEYW25、pEYW26;将上述质粒分别转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis PY79)获得重组菌株BSYW25和BSYW26。荧光显微镜下观察上述重组菌的芽孢,只有BSYW26能检测到荧光,Western blot结果显示BSYW26的芽孢外壳蛋白中含有GFP。结果表明原位整合作为一种新的表面展示方法能够应用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示。     

枯草芽孢杆菌细菌素的分离、表达及稳定性分析

旨在分离枯草芽孢杆菌及其所产细菌素,并分析重组表达后的细菌素的抑菌活性和稳定性。通过牛津杯扩散法筛选羊驼粪便中高产细菌素的芽孢杆菌;借助16S rRNA鉴定分离菌;采用硫酸铵沉淀、氯仿抽提、SDS-PAGE、质谱分析等技术获得细菌素的氨基酸序列;利用大肠杆菌表达系统对细菌素进行体外表达,并利用牛津杯扩散法测定其抑菌活性和稳定性。结果显示,分离菌是一种枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌SXAU18,其可产生抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特菌生长的细菌素;枯草芽孢杆菌SXAU18所产细菌素可能是分子量为10～20 ku的DarA蛋白和两种未知蛋白,属于类细菌素的范畴,将未知蛋白分别命名为BLIS SXAU181和182;经原核表达的BLIS SXAU181和182主要以可溶性上清蛋白形式表达,纯化后为单一条带;重组BLIS SXAU181蛋白没有抑菌活性,重组BLIS SXAU182蛋白具有良好的抑菌活性,且具有耐高温、耐酸碱、耐人工胃液和肠液的的特性。综上,本研究从枯草芽孢杆菌SXAU18分离到具有抑制革兰阳性菌生长活性的细菌素,且重组表达后的BLIS SXAU18...     

抗菌肽Fowlicidin-3在枯草芽孢杆菌中的表达及活性研究

为了在枯草芽孢杆菌中表达具有生物活性的Fowlicidin-3,试验采用人工合成的方法合成小分子泛素样蛋白(SUMO)-Fowlicidin-3,将构建的表达质粒p HT01转化至枯草芽孢杆菌WB800N中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后得到高效表达,用Ni柱亲和层析纯化后,再经SUMO酶切割,通过蛋白质印迹(Western blot)检验Fowlicidin-3在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及酶切情况;采用稀释法抗菌试验检测表达产物的抑菌活性。结果表明:重组Fowlicidin-3在枯草芽孢杆菌中得到高效表达,对6种临床分离菌株的最小抑菌浓度(MIC)在12~16μg/m L之间。说明Fowlicidin-3具有潜在利用价值,可为下一步临床试验提供理论基础。     

炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(＋)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。     

重组PCV3 Cap蛋白植物乳杆菌的构建与表达验证

构建3型猪圆环病毒(PCV3)Cap蛋白的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因(PCV3D),使用无缝克隆技术连接到pSIP411载体中,电转入克隆宿主乳球菌NZ3900中,提取测序结果正确的重组表达质粒NZ3900:pSIP411-PCV3D再次电转入植物乳杆菌Lp12,制备重组菌并验证其表达。结果显示:成功扩增出目的条带为789 bp的经过修饰和优化的PCV3 Cap基因(PCV3D)片段,重组表达质粒电转入植物乳杆菌Lp12,成功构建重组植物乳杆菌Lp12:pSIP411-PCV3D。Western blot、流式细胞术等方法检测重组蛋白表达,获得阳性结果,阳性率为47.9%;免疫荧光进一步表明重组蛋白能够在细胞中表达。本试验成功构建了1株表达PCV3 Cap蛋白的植物乳杆菌,为PCV3口服候选疫苗的开发研究提供依据。     

枯草芽孢杆菌木聚糖酶Xyn B在毕赤酵母中的表达

编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain GD3b)木聚糖酶(Xylanse B,Xyn B)基因从重组载体pUC-XynB中切割,并克隆到pPICZa A载体中,经酶切和测序鉴定,成功构建了分泌型毕赤酵母表达载体pPICZa-Xyn B。载体经线性化后转入毕赤酵母X-33,并筛选获得可通过甲醇诱导分泌表达Xyn B重组蛋白的毕赤酵母工程菌X-33/Xyn B。     

蜜蜂抗菌肽Abaecin在枯草杆菌中的分泌表达

为了在枯草芽孢杆菌中分泌表达具有生物活性的Abaecin,采用重叠延伸PCR方法拼接合成含有编码Abaecin的基因及其相关调控元件的重组表达质粒pGplat.将构建的表达质粒pGplat电击转化至枯草杆菌,筛选正常生长的菌体,摇瓶发酵,取上清液冻干作为样品.通过Western blot试验检测Abaecin在枯草芽孢杆菌中的分泌表达情况.采用琼脂扩散法检测表达产物Abaecin的抑菌活性.Western blot试验结果证实在3.9 ku处有表达产物的目的条带.琼脂扩散法结果证明表达产物Abaecin对大肠杆菌、鸡沙门氏菌等革兰氏阴性菌有抑制活性.试验表明在枯草杆菌中能有效分泌表达具有生物活性的抗菌肽Abaecin.本研究结果为开发全新高效抗生素肽类药物和饲料添加剂提供了理论依据.     

重组鹅β-防御素7蛋白的原核表达及其生物学特性分析

为探讨鹅β-防御素7(Av BD7)的生物学特性,将鹅Av BD7基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体p Pro EX HTa的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒p Pro EX-Av BD7,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对其菌液进行诱导表达。经N-三(羟甲基)甲基甘氨酸十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分析,该重组蛋白大小为10~15 ku,与预期大小结果一致。重组鹅Av BD7蛋白纯化后,通过菌落计数的方法测定其体外抗大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌等抑菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响及其对鸡红细胞的溶血活性。结果显示,重组鹅Av BD7蛋白对所测定的5种细菌均有显著抗菌活性(P0.05),且其抑菌活性随蛋白浓度的增加而增强。高浓度盐离子(150 mmol/L)显著抑制重组鹅Av BD7蛋白的抗菌活性(P0.05)。重组鹅Av BD7蛋白对鸡红细胞没有溶血活性(P0.05)。由此可见,重组鹅Av BD7蛋白具有广谱抗菌活性,高浓度盐离子显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白不具有溶血活性。     

猪脑心肌炎病毒2A蛋白的原核表达与纯化

本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。     

Prokaryotic Expression and Purification of 2A Protein of Porcine Encephalomyocarditis Virus

In this study,encephalomyocarditis virus 2A protein was prokaryotic expressed and purified.E.coli was used to express foreign proteins,the EMCV 2A gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-sumo to obtain the recombinant plasmid pET28a-EMCV-2A and confirmed by PCR and sequencing.The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3).After ultrasound fragmentation,the expression of 2A protein was mainly in the form of inclusion bodies.By optimizing the protein expression conditions,the soluble expression of the target protein could be achieved.The recombinant protein was purified by beads and identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed.The molecular weight of the recombinant 2A protein was about 25 ku.The best condition was 16 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG,about 50% of the proteins were soluble.The purified recombinant protein was double-stained by SDS-PAGE and Western blotting,and indicated that the purified protein was the recombinant protein.The study provided the basic theoretical basis for elucidating the molecular pathogenesis of EMCV and preparation of gene vaccines and antiviral drugs.     

牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494 bp的目的片段,同时用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。     

Cloning and Prokaryotic Expression of L1 Gene of Bovine Papillomavirus Genotype 13

This experiment was conducted to clone and express L1 gene of bovine papillomavirus genotype 13 (BPV13).Specific primers were designed according to the published sequences of BPV13, and 1 494 bp L1 gene fragment was amplified by PCR.After digestion by BamHⅠand Hind Ⅲ, the fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+) to construct the recombinant plasmid pET28a-L1.The recombinant plasmid pET28a-L1 was identified by double enzyme digestion and nucleotide sequencing, and was transformed into E.coli BL21(DE3).The expression of pET28a-L1 was induced by IPTG after selecting the best concentration and time.The results showed that L1 gene was exactly inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+), after induction, the target protein containing His-tag was successfully expressed by expression bacteria which included recombinant plasmid pET28a-L1;SDS-PAGE result showed that the molecular mass of the protein was 60 ku which was consistent with the expected size;After ultrasonic treatment, SDS-PAGE result showed that the protein existed in the precipitation;The target protein was a fusion protein with His-tag verified by Western blotting.This study laid a solid foundation for the research of function of BPV13 L1 gene and the development of effective DNA vaccine of BPV13.     

甲型流感病毒NP蛋白原核表达及其金标检测方法的建立

构建甲型流感病毒NP基因重组质粒,制备NP蛋白,建立甲型流感病毒胶体金检测方法。设计引物,扩增人工合成的甲型流感病毒株A(H5 N1)(GenBank登录号AY585439)NP DNA基因,构建pET-30 Xa/LIC-NP重组质粒,转化入原核表达系统E.coliBL21 Gold中进行表达和纯化。结果制备了纯度高达900 mL/L的甲型流感病毒NP融合蛋白,并初步建立了金标检测方法。