牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494 bp的目的片段,同时用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。     

PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

构建PADRE-TGFβ1原核表达质粒,并对其进行诱导表达和反应原性分析.对PADRE、联接序列(Linker)及TGFβ1的基因序列进行密码子优化,采用全基因合成的方法人工合成全长PADRE-Linker-TGFβ1序列,合成产物克隆至pET-28a(+)质粒.将构建好的质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受...     

减蛋综合征病毒纤维蛋白主要抗原结构域原核表达及抗原性鉴定

利用生物信息学软件对减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127纤维蛋白进行抗原特性分析,人工合成融合基因Knobs,将其克隆到原核表达载体pET28a的多克隆位点,构建原核表达载体pET28a-Knobs,将其转化到感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS中,经30℃、1.0 mmol.L-1IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示:目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为26.0 ku;Western blot结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。本试验为进一步研究EDSV抗原结构域的免疫原性以及减蛋综合征基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

猪脑心肌炎病毒2A蛋白的原核表达与纯化

本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。     

Prokaryotic Expression and Purification of 2A Protein of Porcine Encephalomyocarditis Virus

In this study,encephalomyocarditis virus 2A protein was prokaryotic expressed and purified.E.coli was used to express foreign proteins,the EMCV 2A gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-sumo to obtain the recombinant plasmid pET28a-EMCV-2A and confirmed by PCR and sequencing.The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3).After ultrasound fragmentation,the expression of 2A protein was mainly in the form of inclusion bodies.By optimizing the protein expression conditions,the soluble expression of the target protein could be achieved.The recombinant protein was purified by beads and identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed.The molecular weight of the recombinant 2A protein was about 25 ku.The best condition was 16 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG,about 50% of the proteins were soluble.The purified recombinant protein was double-stained by SDS-PAGE and Western blotting,and indicated that the purified protein was the recombinant protein.The study provided the basic theoretical basis for elucidating the molecular pathogenesis of EMCV and preparation of gene vaccines and antiviral drugs.     

小反刍兽疫病毒F蛋白抗原位点的克隆与表达

目的表达小反刍兽疫F蛋白的抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫的抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中PPRV的F基因的抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经ITPG诱导表达PPRVF基因的抗原位点;用SDS-PAGE和Western-Blotting分析抗原位点蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-F35-111(pZLW013)、PET-28b-F143-485(pZLW014)和PET-28b-F323-485(pZLW015)酶切后,均出现与预期相符的片段;DNA测序表明插入的片段的序列与小反刍兽疫F基因的抗原位点序列分别完全一致,其大小分别为251bp、1053bp和514bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和West-ern-Blotting分析,证明小反刍兽疫抗原位点F35-111没有表达、抗原位点F143-485和F323-485得到表达。结论成功表达了PPRVF基因的两段抗原位点蛋白,为日后检测与预防工作奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gC基因抗原活性区的克隆与表达

通过聚合酶链式反应从牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株中扩增得到病毒gC基因并克隆至T载体pMD20T,再以后者为模板扩增gC蛋白第15~177位氨基酸对应的抗原活性区片段gCd。将gCd插入原核表达载体pET32a构建重组表达质粒pET32a-bhv1gCd。限制性内切酶以及序列分析鉴定表明重组表达质粒克隆片段序列与阅读框正确。对重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)的培养物进行蛋白电泳,可检测到分子量约45ku的目的产物,IPTG诱导后5h表达量最高。免疫印迹试验结果证实,gCd重组蛋白与牛传染性鼻气管炎标准阳性血清发生特异性反应,表明gC抗原活性区片段在原核获得表达并具有良好的抗原性。该重组蛋白可用于建立ELISA等免疫诊断方法。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

兔出血症病毒主要结构蛋白基因的克隆、原核表达及其免疫原性鉴定

本试验采用RT-PCR方法扩增了兔出血症病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后,进行序列测定,将测序正确的纯化产物双酶切,克隆入原核表达载体pET28b(+)中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E.coli Rosetta^TM,用IPTG诱导培养重组表达菌。经SDS-PAGE分析,在分子质量62.0 ku处可见明显的表达带,经Western blotting检测,约在62.0 ku处出现特异性的反应带。结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从细胞毒液中扩增N蛋白cDNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,所获得的重组质粒pET-28a-N经酶切鉴定正确后,将其转化入表达菌E.coliBL21plysS诱导表达,用SDS-PAGE与Western blotting对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为372 bp的N蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h蛋白表达量最高,出现分子质量约为18 ku的目的蛋白带,与N蛋白的理论值相符。经Western blotting检测,该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。获得的PRRSV N蛋白为建立针对该病毒抗体的间接ELISA检测方法,以及为进一步研发PRRS抗体检测试剂盒奠定了基础。     

捻转血矛线虫ES24抗原基因的克隆与表达特性分析

根据捻转血矛线虫ES24抗原基因序列(U64793.1)设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出大小约为670 bp的DNA片段。将该DNA片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果发现该基因与GenBank中已知的捻转血矛线虫24 ku ES抗原基因的相似性达96%～98%。将该基因的开放阅读框插入pET28a(+)载体中,获得原核表达质粒pET28/ES24,并转化大肠杆菌BL21。重组细菌用IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,结果表明该基因获得了表达,重组蛋白分子量大小约为25 ku。用实时荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段、不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示ES24基因在雄性成虫中表达量最高,雌虫和虫卵其次,在第3期幼虫中表达最低。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆与原核表达

构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。     

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及免疫原性分析

构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段的克隆及原核表达

根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802～4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。     

布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析

本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b（Omp2b）基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041 bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38 ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。     

白喉毒素DAB389-aMSH重组毒素的构建及表达

摘要:利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有aMSH全序列作下游引物,以pET28a/DAB389-EGF为模板,PCR扩增DAB389-aMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR I和Nco I酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389-aMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389 -aMSH,转化菌经1mmol/L IPTG、30C诱导5h,用SDS-PAGE 和Western blot 鉴定表达的重组毒素质。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS-PAGE表明,重组毒素相对分子量为43.76KD,且表达量达菌体总蛋白量的31.6%左右。Western blot分析显示,重组毒素能特异性地与抗白喉抗体结合,表明已成功构建表达了重组DAB389-aMSH的工程菌株,表达产物具有生物学活性。     

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of LpxB Gene of Brucella melitensis

The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively.     

羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。     

微小隐孢子虫E2F样结构域包含转录因子CpELD基因的原核和真核表达

为了实现微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)E2F样结构域包含转录因子编码基因cpeld的原核和真核表达,设计2对特异性引物,以C.parvum卵囊cDNA为模板,PCR扩增得到cpeld基因,将其分别插入pET32a和p3XFLAG-CMV14载体。同时设计引物,扩增微小隐孢子虫类钙调蛋白(C.parvum calmoduin-like proteins)的编码基因CpCML,插入pcmv-HA载体。将鉴定正确的重组质粒分别转入BL21(DE3)和293T细胞进行表达,Western blot观察重组蛋白的反应原性。结果显示,成功构建了重组原核表达质粒pET32a-cpeld和真核表达质粒p3XFLAG-CMV14-cpeld以及pcmv-HA-CML;SDS-PAGE显示,重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达出了分子质量约为55 ku的重组蛋白;Western blot分析显示,原核表达的重组蛋白能与鼠抗His单克隆抗体,真核表达重组CpELD和CpCML蛋白能分别与抗FLAG和HA单克隆抗体反应。结果表明,成功实现了cpeld基因的原核和真核表达以及CpCML基因的真核表达,表达产物具有良好的反应原性,为后续开展隐孢子虫CpELD和CpCML的功能和作用机制研究、新型的防控技术研发奠定了基础。